腺病毒介導的LacZ基因在脊髓表達的影響因素.pdf

1、目的：隨著交通事業(yè)及工農業(yè)的發(fā)展，周圍神經損傷是臨床上常見的致殘性疾病，而周圍神經損傷的治療一直是臨床上棘手的問題，目前基因治療的研究已經成為周圍損傷研究領域的前沿課題和熱點。其中腺病毒載體(Adenovirus,AdV)在介導基因轉染方面已表現(xiàn)出多方面的優(yōu)勢，使得AdV成為神經再生、神經示蹤研究及神經肌肉疾病基因治療的實驗研究中最具魅力的載體之一。將一些外源性的基因通過AdV導入神經系統(tǒng)內，通過導入的外源性基因在神經系統(tǒng)內的表達來發(fā)揮

2、作用，促進周圍神經的再生，其中最主要的問題是外源性基因在脊髓及周圍神經細胞中的表達情況。本實驗將將攜帶LacZ基因的AdV(AdLacZ)與不帶外源基因的AdO或與攜帶有細胞毒T淋巴細胞相關抗原4免疫球蛋白(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4immunoglobulin，CTLA4Ig)基因的AdV(AdCTLA4Ig)通過微量注射導入大鼠腰膨大脊髓實質內，比較共同轉染AdCTLA4I

3、g后β-gal在脊髓表達水平變化：通過多聚酶鏈反應(PCR)監(jiān)測腺病毒注入后在脊髓的消失時間和采用病毒液10倍系列稀釋提取DNA檢測出腺病毒的特異性條帶的最低稀釋度及逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)法檢測比較CTLA4Ig基因和LacZ基因在大鼠脊髓的表達，并用流式細胞儀來測定血中淋巴細胞亞群的變化，以探討CTLA4Ig誘導機體對AdLacZ的免疫耐受的作用及其機理，觀察腺病毒在脊髓表達的影響因素。 方法：選用7周齡健康雌性W

4、ister大鼠200只，體重200～250g。將大鼠隨機分成兩組，每組100只。對照組(A組)導入AdlacZ+AdO，實驗組(B組)導入AdlacZ+AdCTLA4Ig。將大鼠經腹腔注射氯胺酮/塞拉嗪麻醉(75-100mg/kg+5mg/kg)，麻醉成功后固定于腦立體定位儀上。取長約2cm后正中切口，去除T13椎板暴露脊髓腰膨大部位。利用微量注射器及ST-Ⅲ型手動推進器，于脊髓后正中動脈右側0.8mm處注射AdlacZ(1×109pf

5、u/ml)和AdO(5×109pfu/ml)各1μl(A組)或AdLacZ(1×109 pfu/ml)和AdCTLA4Ig(5×109pfu/ml)各1μl(B組)。針尖向頭側呈45度斜行進針，斜行刺入深度為2.5mm。注射速度為1μl/min，注射完畢后滯針5min，緩慢拔針。充分止血、沖洗傷口，局部噴灑抗生素預防感染，關閉傷口。兩組在轉染病毒后10個不同的時間點鼠尾靜脈取血2ml；在轉染后10個不同時間點，對兩組動物脊髓進行厚50μ

6、m的連續(xù)冰凍橫切片，計數A組與B組中X-gal染色陽性的切片數，分析比較兩組LacZ基因在脊髓表達的高峰期和持續(xù)時間；多聚酶鏈反應(PCR)監(jiān)測腺病毒注入后在脊髓的消失時間采用病毒液10倍系列稀釋提取DNA檢測出腺病毒的靈敏度及逆轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)法檢測CTLA4Ig基因和LacZ基因在大鼠脊髓的表達，并用流式細胞儀來測定血中淋巴細胞亞群CD4和CD8的變化。 結果： 1.X-gal，CTL,A4Ig轉基因

7、表達：LacZ基因和CTLA4Ig基因轉染脊髓雙側的前角運動細胞和周圍的膠質細胞。轉基因表達范圍局限于注射點上下各0.6cm區(qū)段，有轉基因表達的陽性冰凍橫切片數≤240片。轉基因神經元在注射同側表達較對側強烈。切片觀察可見A組的X-gal染色陽性表達時間約為2周；而B組的X-gal染色陽性表達時間約為4周。脊髓陽性切片計數顯示兩組β-gal在脊髓表達的高峰期均在2～8天，統(tǒng)計學分析表明兩組之間在高峰期間陽性切片數無顯著差異(P＞0.05

8、)。 2 PCR檢測2.1腺病毒液PCR檢測：腺病毒的表達量隨著濃度的降低而逐漸減小。采用病毒液10倍系列稀釋提取后DNA經PCR反應可檢測出腺病毒的特異性條帶的最低稀釋度為10-4。AdlacZ(1×109pfu/ml)與AdO(5×109 pfu/ml)特異性條帶的最低稀釋度一致。 2.2脊髓標本腺病毒PCR檢測：用PCR法從DNA水平分別檢測腺病毒在對照組、實驗組的表達情況，腺病毒的DNA量是隨時間延長逐漸下降的，直至第1

9、0周檢測不到腺病毒的表達。 3：RT-PCR檢測：轉染后均可見β-gal和CTLA4IgmRNA的表達。B組β-gal表達時間長于A組。統(tǒng)計學分析表明兩組之間β-gal表達量無顯著差異(P＞0.05)。 3.1 β-galmRNA在大鼠脊髓組織的表達：用RT-PCR.法從mRNA水平分別檢測β-gal在對照組、實驗組的表達情況：轉染1天后兩組均可檢測出βgalmRNA在大鼠脊髓組織的表達，對照組實驗組表達上調高峰均為術后

10、3天，高表達量可以持續(xù)到3周，對照組到第8周完全消失。實驗組到第9周完全消失。統(tǒng)計學分析表明兩組之間在高峰期間細胞表達數無顯著差異(P＞0.05)，組內不同時間點比較細胞表達數有顯著差異(P＜0.05)。 3.2 CTLA4IgmRNA在大鼠脊髓組織的表達：用RT-PCR法從mRNA水平分別檢測CTLA4IgmRNA在實驗組的表達情況。轉染一天后實驗組可檢測出CTLA4IgmRNA在大鼠脊髓組織的表達，表達上調高峰為術后3-5天，高表達

11、量可以持續(xù)到3周，到第9周完全消失。 4 流式細胞學檢測：流式細胞儀分析顯示，兩組轉染后1天血中CD4、CD8淋巴細胞開始升高，2天CD8淋巴細胞顯著升高，而CD4淋巴細胞則在轉染后第6天開始顯著升高，兩種細胞直至9天左右達到高峰，兩周后CD4淋巴細胞保持在一個穩(wěn)定的水平，CD8淋巴細胞隨著時間數量逐漸減少。實驗組CD4、CD8淋巴細胞數值均小于對照組，統(tǒng)計學分析表明兩組之間在高峰期間細胞表達數無顯著差異(P＞0.05)，組內不