復(fù)合雪旺細(xì)胞的小腸粘膜下層構(gòu)建組織工程化人工神經(jīng)修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的研究.pdf

1、長距離周圍神經(jīng)缺損的修復(fù),一直是臨床上較為棘手的難題。目前臨床上最常用的治療是自體神經(jīng)移植,但是它存在著明顯的缺點(diǎn),如可供移植的神經(jīng)數(shù)量和長度有限,造成供區(qū)的功能障礙,大小難以匹配和可造成錯(cuò)向再生等。近年來,利用組織工程技術(shù)研制一種可替代自體神經(jīng)移植的人工神經(jīng)是研究的熱點(diǎn)。雪旺細(xì)胞(Schwann cells, SCs)在周圍神經(jīng)的發(fā)生、發(fā)育、形態(tài)、功能維持方面發(fā)揮著非常重要的作用,已被廣泛用作周圍神經(jīng)組織工程的種子細(xì)胞。除了種子細(xì)胞以

2、外,合適的支架材料是構(gòu)建組織工程化人工神經(jīng)的關(guān)鍵。目前主要應(yīng)用于修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的材料包括人工合成的材料如各種聚合物,和天然材料如血管、變性肌肉、膠原、明膠等。但是這些材料都存在著一定的缺點(diǎn),迄今為止尚不能真正地在臨床上替代自體神經(jīng)移植修復(fù)長距離周圍神經(jīng)缺損。小腸粘膜下層(small intestinal submucosa, SIS)是一種天然的細(xì)胞外基質(zhì)材料,接近于天然結(jié)締組織復(fù)雜的成份結(jié)構(gòu),其結(jié)構(gòu)與細(xì)胞更具有親和力。作為一種生物材

3、料,SIS中既不含血管又不含細(xì)胞,作為異種移植物植入體內(nèi),不會(huì)引起明顯有害的免疫排斥反應(yīng)。目前SIS已作為組織工程的支架材料廣泛應(yīng)用于下尿路、膀胱、血管、肌腱、韌帶、骨、半月板、腹壁、硬腦膜、筋膜等多種組織缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究中,取得了令人滿意的效果,具有非常良好的應(yīng)用前景。我們?cè)鴳?yīng)用單純豬SIS修復(fù)大鼠1cm短距離坐骨神經(jīng)缺損,取得了良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)首先在體外分離培養(yǎng)新生鼠雪旺細(xì)胞,并進(jìn)行純化、鑒定和傳代。制備好SIS并

4、進(jìn)行生長因子檢測和生物安全性評(píng)價(jià)。然后將SIS與雪旺細(xì)胞進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)并檢測兩者的生物相容性。以雪旺細(xì)胞為種子細(xì)胞,SIS為支架材料,構(gòu)建組織工程化人工神經(jīng)導(dǎo)管來修復(fù)大鼠14mm坐骨神經(jīng)缺損,并與單純SIS導(dǎo)管和自體神經(jīng)移植作對(duì)照,通過多種方法綜合分析評(píng)價(jià)修復(fù)效果和機(jī)制,探討其修復(fù)長距離周圍神經(jīng)缺損的可行性。首先,探討新生鼠雪旺細(xì)胞體外分離培養(yǎng)和純化的方法。通過酶消化法從新生鼠的周圍神經(jīng)體外初步分離出雪旺細(xì)胞,24h后加入阿糖胞苷(1

5、0-5mol/L)以抑制成纖維細(xì)胞生長,傳代時(shí)應(yīng)用差速貼壁法進(jìn)一步去除成纖維細(xì)胞,達(dá)到純化雪旺細(xì)胞的目的。培養(yǎng)液中加入牛腦垂體浸出液(40μg/ml)刺激雪旺細(xì)胞的迅速分裂增殖,這樣可獲得大量純度高達(dá)97%的雪旺細(xì)胞作為種子細(xì)胞。本方法具有簡單方便、耗時(shí)少和細(xì)胞純度高等優(yōu)點(diǎn)。其次,進(jìn)行SIS的制備、生長因子檢測和生物安全性評(píng)價(jià)。首先通過機(jī)械刮除方法去除粘膜層、肌層和漿膜層,初步得到SIS。進(jìn)一步應(yīng)用化學(xué)方法進(jìn)行脫細(xì)胞和滅菌處理。最后凍干

6、消毒后保存。經(jīng)光鏡和掃描電鏡檢測表明制備好的SIS已基本去除殘留細(xì)胞,沒有對(duì)其超微結(jié)構(gòu)和膠原纖維的熱穩(wěn)定性造成損害,具有適合細(xì)胞生長的三維結(jié)構(gòu),可用作周圍神經(jīng)組織工程的支架材料。ELISA法檢測證實(shí),SIS中含有血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β),其含量與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。熱源試驗(yàn)顯示動(dòng)物注射SIS浸提液后體溫升高在允許范圍內(nèi),說明沒有熱源物質(zhì)殘留。皮膚刺激試驗(yàn)和體內(nèi)植入研究發(fā)現(xiàn),無膿腫及瘺管形成,組織切片發(fā)現(xiàn)

7、SIS植入后組織反應(yīng)在早期呈現(xiàn)出異物刺激引起輕中度炎性反應(yīng),中期時(shí)炎癥細(xì)胞減少,以淋巴細(xì)胞為主,炎癥反應(yīng)和抗原反應(yīng)都較小,同時(shí)進(jìn)行程序性的降解。12周時(shí)SIS幾乎完全降解吸收。未見肌肉組織變性和壞死。血清IgG亞型檢測見SIS植入第1周時(shí)小鼠血清中IgG1亞型明顯增高,第4周時(shí)達(dá)到最高值,然后逐漸開始下降,12周時(shí)接近于正常。而IgG2a,IgG2b亞型在SIS植入體內(nèi)整個(gè)期間并無較大的波動(dòng)。結(jié)果證實(shí)我們制備的SIS作為一種異種來源生物

8、材料,具有較好的組織相容性,對(duì)機(jī)體全身和局部無毒性,植入體內(nèi)后并不會(huì)引起明顯的對(duì)受體有害的炎癥和免疫排斥反應(yīng),能夠安全地應(yīng)用于機(jī)體內(nèi)修復(fù)組織缺損。再次,將制備好的SIS與雪旺細(xì)胞在體外進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)并研究其生物相容性。將雪旺細(xì)胞懸液滴種于SIS表面,不同時(shí)間段觀察雪旺細(xì)胞在SIS上的粘附、增殖、分化及細(xì)胞活性情況,并檢測細(xì)胞的神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌活性。MTT法證實(shí)雪旺細(xì)胞在SIS表面有良好的增殖活性, SIS對(duì)雪旺細(xì)胞并無細(xì)胞毒性作用。相差

9、顯微鏡、組織切片和掃描電鏡可見雪旺細(xì)胞在SIS表面附著和生長增殖良好,附著于材料的孔隙周邊或深入材料孔隙內(nèi)生長,5~7天后逐漸長滿材料表面。雪旺細(xì)胞分裂增殖呈三維生長,細(xì)胞形態(tài)多為長梭形,紡錘形或長三角形,突起顯著,細(xì)胞呈端對(duì)端的相互連接或排列成束狀或柵欄狀,細(xì)胞表面蛋白顆粒分泌良好。透射電鏡可見SIS表面雪旺旺細(xì)胞生長狀態(tài)良好,細(xì)胞胞體呈長梭形,膜表面有微絨毛突起,細(xì)胞緊密貼附生長于SIS表面,局部可見重疊生長。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見核糖體和線粒

10、體豐富,分布于核周。雪旺細(xì)胞與SIS交界部見細(xì)胞底部形成許多突起與SIS緊密接觸。此外,通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)雪旺細(xì)胞與SIS復(fù)合培養(yǎng)后分泌NGF-β和BDNF的神經(jīng)營養(yǎng)因子功能良好,分泌量隨著時(shí)間的延長而逐漸增高,與正常培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞無顯著性差異。RT-PCR結(jié)果顯示雪旺細(xì)胞與SIS復(fù)合培養(yǎng)后NGF-βmRNA和BDNF mRNA均表達(dá)良好。同時(shí)還證實(shí)雪旺細(xì)胞與SIS復(fù)合培養(yǎng)后5~7天時(shí),雪旺細(xì)胞在SIS表面生長的密度較高,細(xì)胞因子分

11、泌水平也達(dá)到較高的水平,是進(jìn)行體內(nèi)移植的最佳時(shí)期。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明SIS與雪旺細(xì)胞具有良好的生物相容性,為進(jìn)一步利用SIS與雪旺細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建人工神經(jīng)導(dǎo)管進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究打下基礎(chǔ)。最后,以雪旺細(xì)胞為種子細(xì)胞,SIS為支架材料,體外復(fù)合培養(yǎng)后構(gòu)建組織工程化人工神經(jīng)來修復(fù)大鼠14mm坐骨神經(jīng)缺損,以單純SIS導(dǎo)管和自體神經(jīng)移植作對(duì)照。通過大體觀察、電生理檢測、組織學(xué)、免疫組化、圖像分析、超微結(jié)構(gòu)、逆行示蹤和血供重建等多方面分析評(píng)價(jià)修復(fù)效果和機(jī)制

12、。結(jié)果顯示,術(shù)后16周,SIS復(fù)合雪旺細(xì)胞組患肢潰瘍基本愈合,移植段與近、遠(yuǎn)坐骨神經(jīng)直徑相當(dāng),外觀相似,未見神經(jīng)瘤形成,外膜表面可見豐富的再生血管網(wǎng)。電生理功能檢測見神經(jīng)傳導(dǎo)速度(NCV)和復(fù)合動(dòng)作電位的波幅(AMP)與自體神經(jīng)移植組相比無顯著差異。組織學(xué)檢查示再生神經(jīng)纖維已順利通過缺損區(qū),排列整齊呈束狀,含有大量的有髓神經(jīng)纖維,且髓鞘較厚。圖像分析見再生神經(jīng)組織面積百分比、有髓神經(jīng)纖維密度和髓鞘厚度與自體神經(jīng)移植組相比無顯著差異。NF

13、-160/200免疫組化染色結(jié)果顯示,再生神經(jīng)纖維中陽性表達(dá)量較多,排列整齊,連續(xù)性較好,與自體神經(jīng)移植組相似。透射電鏡見再生神經(jīng)纖維呈較成熟形態(tài)學(xué)表現(xiàn),粗細(xì)不等的有髓及無髓纖維較均勻地分布,髓鞘板層清晰。大鼠小腿三頭肌重量接近于自體神經(jīng)移植。逆行示蹤檢測顯示大量真藍(lán)標(biāo)記陽性的L3~6背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元和脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,證實(shí)再生感覺神經(jīng)纖維和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維傳入通路均通暢。通過血管墨汁灌注和核素掃描方法進(jìn)行血供重建分析證實(shí)了神經(jīng)缺損局