復合雪旺細胞的小腸粘膜下層構(gòu)建組織工程化人工神經(jīng)修復周圍神經(jīng)缺損的研究.pdf

1、長距離周圍神經(jīng)缺損的修復,一直是臨床上較為棘手的難題。目前臨床上最常用的治療是自體神經(jīng)移植,但是它存在著明顯的缺點,如可供移植的神經(jīng)數(shù)量和長度有限,造成供區(qū)的功能障礙,大小難以匹配和可造成錯向再生等。近年來,利用組織工程技術(shù)研制一種可替代自體神經(jīng)移植的人工神經(jīng)是研究的熱點。雪旺細胞(Schwann cells, SCs)在周圍神經(jīng)的發(fā)生、發(fā)育、形態(tài)、功能維持方面發(fā)揮著非常重要的作用,已被廣泛用作周圍神經(jīng)組織工程的種子細胞。除了種子細胞以

2、外,合適的支架材料是構(gòu)建組織工程化人工神經(jīng)的關(guān)鍵。目前主要應用于修復周圍神經(jīng)缺損的材料包括人工合成的材料如各種聚合物,和天然材料如血管、變性肌肉、膠原、明膠等。但是這些材料都存在著一定的缺點,迄今為止尚不能真正地在臨床上替代自體神經(jīng)移植修復長距離周圍神經(jīng)缺損。小腸粘膜下層(small intestinal submucosa, SIS)是一種天然的細胞外基質(zhì)材料,接近于天然結(jié)締組織復雜的成份結(jié)構(gòu),其結(jié)構(gòu)與細胞更具有親和力。作為一種生物材

3、料,SIS中既不含血管又不含細胞,作為異種移植物植入體內(nèi),不會引起明顯有害的免疫排斥反應。目前SIS已作為組織工程的支架材料廣泛應用于下尿路、膀胱、血管、肌腱、韌帶、骨、半月板、腹壁、硬腦膜、筋膜等多種組織缺損修復的實驗研究和臨床研究中,取得了令人滿意的效果,具有非常良好的應用前景。我們曾應用單純豬SIS修復大鼠1cm短距離坐骨神經(jīng)缺損,取得了良好的實驗結(jié)果。本實驗首先在體外分離培養(yǎng)新生鼠雪旺細胞,并進行純化、鑒定和傳代。制備好SIS并

4、進行生長因子檢測和生物安全性評價。然后將SIS與雪旺細胞進行體外復合培養(yǎng)并檢測兩者的生物相容性。以雪旺細胞為種子細胞,SIS為支架材料,構(gòu)建組織工程化人工神經(jīng)導管來修復大鼠14mm坐骨神經(jīng)缺損,并與單純SIS導管和自體神經(jīng)移植作對照,通過多種方法綜合分析評價修復效果和機制,探討其修復長距離周圍神經(jīng)缺損的可行性。首先,探討新生鼠雪旺細胞體外分離培養(yǎng)和純化的方法。通過酶消化法從新生鼠的周圍神經(jīng)體外初步分離出雪旺細胞,24h后加入阿糖胞苷(1

5、0-5mol/L)以抑制成纖維細胞生長,傳代時應用差速貼壁法進一步去除成纖維細胞,達到純化雪旺細胞的目的。培養(yǎng)液中加入牛腦垂體浸出液(40μg/ml)刺激雪旺細胞的迅速分裂增殖,這樣可獲得大量純度高達97%的雪旺細胞作為種子細胞。本方法具有簡單方便、耗時少和細胞純度高等優(yōu)點。其次,進行SIS的制備、生長因子檢測和生物安全性評價。首先通過機械刮除方法去除粘膜層、肌層和漿膜層,初步得到SIS。進一步應用化學方法進行脫細胞和滅菌處理。最后凍干

6、消毒后保存。經(jīng)光鏡和掃描電鏡檢測表明制備好的SIS已基本去除殘留細胞,沒有對其超微結(jié)構(gòu)和膠原纖維的熱穩(wěn)定性造成損害,具有適合細胞生長的三維結(jié)構(gòu),可用作周圍神經(jīng)組織工程的支架材料。ELISA法檢測證實,SIS中含有血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β),其含量與文獻報道基本一致。熱源試驗顯示動物注射SIS浸提液后體溫升高在允許范圍內(nèi),說明沒有熱源物質(zhì)殘留。皮膚刺激試驗和體內(nèi)植入研究發(fā)現(xiàn),無膿腫及瘺管形成,組織切片發(fā)現(xiàn)

7、SIS植入后組織反應在早期呈現(xiàn)出異物刺激引起輕中度炎性反應,中期時炎癥細胞減少,以淋巴細胞為主,炎癥反應和抗原反應都較小,同時進行程序性的降解。12周時SIS幾乎完全降解吸收。未見肌肉組織變性和壞死。血清IgG亞型檢測見SIS植入第1周時小鼠血清中IgG1亞型明顯增高,第4周時達到最高值,然后逐漸開始下降,12周時接近于正常。而IgG2a,IgG2b亞型在SIS植入體內(nèi)整個期間并無較大的波動。結(jié)果證實我們制備的SIS作為一種異種來源生物

8、材料,具有較好的組織相容性,對機體全身和局部無毒性,植入體內(nèi)后并不會引起明顯的對受體有害的炎癥和免疫排斥反應,能夠安全地應用于機體內(nèi)修復組織缺損。再次,將制備好的SIS與雪旺細胞在體外進行復合培養(yǎng)并研究其生物相容性。將雪旺細胞懸液滴種于SIS表面,不同時間段觀察雪旺細胞在SIS上的粘附、增殖、分化及細胞活性情況,并檢測細胞的神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌活性。MTT法證實雪旺細胞在SIS表面有良好的增殖活性, SIS對雪旺細胞并無細胞毒性作用。相差

9、顯微鏡、組織切片和掃描電鏡可見雪旺細胞在SIS表面附著和生長增殖良好,附著于材料的孔隙周邊或深入材料孔隙內(nèi)生長,5~7天后逐漸長滿材料表面。雪旺細胞分裂增殖呈三維生長,細胞形態(tài)多為長梭形,紡錘形或長三角形,突起顯著,細胞呈端對端的相互連接或排列成束狀或柵欄狀,細胞表面蛋白顆粒分泌良好。透射電鏡可見SIS表面雪旺旺細胞生長狀態(tài)良好,細胞胞體呈長梭形,膜表面有微絨毛突起,細胞緊密貼附生長于SIS表面,局部可見重疊生長。細胞質(zhì)內(nèi)見核糖體和線粒

10、體豐富,分布于核周。雪旺細胞與SIS交界部見細胞底部形成許多突起與SIS緊密接觸。此外,通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)雪旺細胞與SIS復合培養(yǎng)后分泌NGF-β和BDNF的神經(jīng)營養(yǎng)因子功能良好,分泌量隨著時間的延長而逐漸增高,與正常培養(yǎng)的雪旺細胞無顯著性差異。RT-PCR結(jié)果顯示雪旺細胞與SIS復合培養(yǎng)后NGF-βmRNA和BDNF mRNA均表達良好。同時還證實雪旺細胞與SIS復合培養(yǎng)后5~7天時,雪旺細胞在SIS表面生長的密度較高,細胞因子分

11、泌水平也達到較高的水平,是進行體內(nèi)移植的最佳時期。本實驗結(jié)果證明SIS與雪旺細胞具有良好的生物相容性,為進一步利用SIS與雪旺細胞復合構(gòu)建人工神經(jīng)導管進行體內(nèi)實驗研究打下基礎(chǔ)。最后,以雪旺細胞為種子細胞,SIS為支架材料,體外復合培養(yǎng)后構(gòu)建組織工程化人工神經(jīng)來修復大鼠14mm坐骨神經(jīng)缺損,以單純SIS導管和自體神經(jīng)移植作對照。通過大體觀察、電生理檢測、組織學、免疫組化、圖像分析、超微結(jié)構(gòu)、逆行示蹤和血供重建等多方面分析評價修復效果和機制

12、。結(jié)果顯示,術(shù)后16周,SIS復合雪旺細胞組患肢潰瘍基本愈合,移植段與近、遠坐骨神經(jīng)直徑相當,外觀相似,未見神經(jīng)瘤形成,外膜表面可見豐富的再生血管網(wǎng)。電生理功能檢測見神經(jīng)傳導速度(NCV)和復合動作電位的波幅(AMP)與自體神經(jīng)移植組相比無顯著差異。組織學檢查示再生神經(jīng)纖維已順利通過缺損區(qū),排列整齊呈束狀,含有大量的有髓神經(jīng)纖維,且髓鞘較厚。圖像分析見再生神經(jīng)組織面積百分比、有髓神經(jīng)纖維密度和髓鞘厚度與自體神經(jīng)移植組相比無顯著差異。NF

13、-160/200免疫組化染色結(jié)果顯示,再生神經(jīng)纖維中陽性表達量較多,排列整齊,連續(xù)性較好,與自體神經(jīng)移植組相似。透射電鏡見再生神經(jīng)纖維呈較成熟形態(tài)學表現(xiàn),粗細不等的有髓及無髓纖維較均勻地分布,髓鞘板層清晰。大鼠小腿三頭肌重量接近于自體神經(jīng)移植。逆行示蹤檢測顯示大量真藍標記陽性的L3~6背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元和脊髓前角運動神經(jīng)元,證實再生感覺神經(jīng)纖維和運動神經(jīng)纖維傳入通路均通暢。通過血管墨汁灌注和核素掃描方法進行血供重建分析證實了神經(jīng)缺損局