石斛屬植物菌根生物學研究.pdf

1、石斛為我國名貴中藥材，石斛屬多種植物均用作商品石斛藥材。石斛來源植物復雜，通常以莖的結構特征作為鑒定依據，但莖的結構特征有限，很難區(qū)分所有的種類，這就要求有更多的形態(tài)特征來輔助鑒定，而根的解剖特點可作為重要的參考依據之一。目前，石斛約材的需求量的不斷增加，而石斛屬植物生境較為獨特，自然繁殖率低，人工栽培難以大面積推廣，導致天然石斛無序采集，自然資源銳減，部分石斛種瀕臨滅絕。石斛屬植物具有蘭科植物典型的菌根特征，在自然條件下生長的石斛種子

2、萌發(fā)、植株營養(yǎng)生長、生殖生長均需要與菌根真菌共生。 本文系統(tǒng)地研究了石斛屬植物根和菌根的解剖學結構特征，對石斛屬植物的內生真菌進行了分離培養(yǎng)，研究了石斛屬植物內生真菌對金釵石斛和鐵皮石斛的作用，并對能夠促進金釵石斛苗生長的內生真兇進行了分類鑒定。 對中國石斛屬34種植物42個材料根的解剖結構進行了系統(tǒng)研究，石斛屬植物根的結構為典型的單子葉植物根的結構，其從外到內依次為根被、外皮層、皮層、內皮層、中柱鞘、維管束和髓。首次發(fā)

3、現了長距石斛、美花石斛和細莖石斛根的外皮層通道細胞外側，有纖維體(Tilosome)結構的存在。提出了根解剖結構特征如根被最內層細胞的Ⅴ型加厚、外皮層通道細胞外側的纖維體、外皮層細胞的加厚方式、內皮層細胞的形狀及髓的類型可以作為屬下種間的鑒別主要特征；同時指出根被的層數、細胞的形狀受石斛生K環(huán)境的影響較大，不易作為分類鑒定的特征；根被的形狀與石斛的附生習性具有相關性，在根系附著基質的一側，根被變窄，細胞受劍擠壓，細胞層數也略少于暴露的一

4、側。比較野生金釵石斛與人工栽培的壯苗和弱苗、野生鐵皮石斛與人工栽培的壯苗和弱苗根的解剖結構發(fā)現，野生石斛與人工栽培的壯苗和弱苗在結構上的差異僅體現在根被的層數、厚度，維管束的數量上的變化，其結果為野生石斛高于人工栽培石斛，人工栽培的壯苗高于弱苗。 首次采用聚類分析的方法，對石斛屬25種植物根的解剖結構特征轉化的數據進行分析，基于根的解剖結構特征建立了石斛屬植物種間的系統(tǒng)發(fā)育樹。該系統(tǒng)發(fā)育樹將25種石斛劃分為4個類群，這與中國植物

5、志描述的石斛屬植物屬下組的劃分具有一定的相關性。根據GeneBank數據中已知石斛屬植物的rDNAITS序列，對本實驗中石斛屬的19種石斛植物構建了分子系統(tǒng)發(fā)育樹，考察了石斛屬植物種間的分子親緣關系。比較基于根的解剖結構特征的種間親緣關系和分子親緣關系，發(fā)現二者不具有相關性；分子親緣關系與石斛屬植物屬下組的劃分也存在分歧。 通過對石斛屬34種植物42個材料的菌根解剖結構的系統(tǒng)研究，發(fā)現菌根的主要特征為真菌從根被最外層細胞或根毛侵

6、入根被組織，主要以菌絲的形式在根被組織中擴展，但僅觀察劍金釵石斛根中的真菌充滿某一根被細胞的現象。菌根真菌從外皮層通道細胞進入皮層紐織，在通道細胞中既可以菌絲形式直接穿過，也可圍繞細胞核形成菌絲圈或菌絲團結構；皮層細胞中還可觀察到有菌根真菌形成的疏松的菌絲團、衰敗的菌絲團及二者共存的現象，菌絲團的形成是蘭科植物菌根形成的典型特征。在一些皮層細胞中，疏松的菌絲團圍繞著衰敗的菌絲團存在。進一步的研究發(fā)現菌絲團在皮層中的分布位置與石斛屬植物附

7、生習性相關，根系附著基質一側的皮層細胞中菌絲團密度較高。菌絲團主要在皮層中間的細胞中形成，而皮層最內側1～2層細胞中，菌絲團沒有分布或數量很少。菌根真菌一般不侵入內皮層和中柱，只有大苞鞘石斛和鐵皮石斛的內皮層通道細胞和中柱鞘通道細胞中有菌絲團的存在，該現象在石斛屬正常生長著的植物菌根研究中尚為首次發(fā)現。石斛屬植物根的皮層中，菌根真菌的定殖率為0～80％，其中黑毛石斛高達70％～80％；而長距石斛等的皮層中沒有菌根真菌的定殖。野生石斛、人

8、工栽培的壯苗和弱苗的菌根結構存在差異，弱苗的皮層細胞中沒有菌絲團結構或者僅存在衰敗的菌絲團，其真菌的定殖率也低于野生石斛和人工栽培的壯苗。 首次對石斛屬34種植物42個材料中的內生真菌進行了系統(tǒng)分離和培養(yǎng)，共分離得劍1313個內生真菌菌株，不同的植物其內生真菌的數量不同，內生真菌侵染率、分離率也不同。石斛中內生真菌的總侵染率分布在25.7％～61.1％；內生真菌分離率為0.29～1.18。石斛屬植物內生真菌具有多樣性特征，多樣性

9、指數分布在1.75-4.33之間。根據內生真菌的培養(yǎng)特征，可將出現頻率高的菌株劃分為10個形態(tài)類群，不同形態(tài)類群的菌株在石斛屬植物中的分布不同，發(fā)生頻度也存在著異。 完成了本實驗所得1313株內生真菌對石斛苗生長影響的篩選工作。篩選出了36個對金釵石斛苗有促生長作用的菌株、8個對鐵皮石斛苗有促生長作用的菌株；對接種活性菌株的石斛苗根進行了侵染檢測，發(fā)現內生真菌均可以侵入石斛苗根的根被組織，部分真菌可以穿過外皮層通道細胞進入皮層組

10、織，其中菌株22-R-4和G08-R-17可以在石斛苗皮層中形成菌絲團結構。這些有促生長作用的真菌一般不能侵染石斛苗根的維管束，而能夠侵染維管束的真菌不利于石斛苗的生長。內生真菌還能夠影響石斛苗的化學成分含量。在瓊脂培養(yǎng)基上，接種菌株22-R-4的金釵石角斗苗總生物堿含量高于未接種組，接菌的鐵皮石斛卣總多糖含量與末接種組相差不大。但在木屑支持物上，接種菌株22-R-4降低了金釵石斛苗總生物堿含量，也降低了鐵皮石斛苗總多糖含量。免疫組織化