馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白對細胞的粘附作用.pdf

1、馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)對集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展危害嚴重，同時對養(yǎng)豬業(yè)的相關從業(yè)人員的健康具有潛在威脅。馬鏈球菌獸疫亞種的類M蛋白是一種重要的表面蛋白和毒力因子，具有調(diào)理素功能，且能夠抵抗抗體的吞噬細胞對其的吞噬作用。本試驗在分子水平上對馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白的粘附機制進行了研究，為該菌的致病機制及引起的豬鏈球菌病的防控進行了有益的探索。 根據(jù)已發(fā)表的馬鏈球菌

2、獸疫亞種豬源ATCC35246株的類M蛋白基因序列，設計和合成一對引物，并以ATCC35246株的基因組DNA為模板，通過PCR技術，擴增出去掉信號肽的類M蛋白基因并定向克隆至表達載體pET-32a(+)中。重組質粒通過酶切鑒定和測序后，將重組質粒轉化入大腸桿菌BL21進行原核表達，SDS-PAGE顯示表達產(chǎn)物約60kD，Western blot顯示，其與ATCC35246株多克隆抗血清反應，抗原性良好。 以His親和層析拄純化

3、重組的類M蛋白作為抗原免疫6～8周齡的BALB／c小鼠，三次免疫后，取脾細胞并與對數(shù)期生長良好的SP2／0細胞進行融合，應用滅活的ATCC35246菌液為包被抗原，建立間接EIASA篩選陽性克隆，經(jīng)過3次亞克隆之后得到12株穩(wěn)定分泌抗類M蛋白單抗的細胞株，特異性檢測顯示其與豬鏈球菌2型等沒有交叉反應。以BABL／c小鼠制備的腹水單抗，ELISA效價約為1:10000。 采用通用的模式細胞HEp-2細胞，研究馬鏈球菌獸疫亞種ATC

4、C35246株類M蛋白的粘附作用。結果顯示，ATCC35246株可以粘附HEp-2細胞，它可以粘附細胞。用重組的類M蛋白預處理HEp-2細胞，當類M蛋白的量達到160μg／500μL，可以完全抑制細胞對細菌的粘附；用重組表達的類M蛋白鼠單抗血清處理ATCC35246，可抑制其對HEp-2細胞的粘附，在1:200倍稀釋時即能完全抑制它對HEp-2細胞的粘附：而ATCC35246的全菌鼠抗血清在1:200時能完全抑制它對HEp-2細胞的粘附

5、。同時，以12株單抗處理細菌以后，發(fā)現(xiàn)單抗2C8具有明顯抑制細胞粘附的作用，說明2C8對應的抗原表位在細胞粘附中具有決定性作用。 以類M蛋白的單抗細胞株2C8分泌的單抗作為靶分子，研究其對應的抗原表位。用從前以試驗得到的2C8單抗包被酶標條孔，從12肽隨機肽庫中經(jīng)過5輪生物淘洗(結合、淘洗及富集)程序進行篩選，第2輪以后降低2C8的包被濃度，同時升高洗液中吐溫-20的濃度。經(jīng)5輪親和篩選后，噬菌體的回收率從1.71×10<'-6

6、>增加到3.39×10<'-4>假陽性率逐輪降低，由20.31％降至0.22％，表明陽性克隆得到了有效富集。從第5輪篩選出的陽性克隆中隨機挑取14個進行擴增，然后對這些克隆采用ELISA和競爭ELISA來鑒定其結合性和特異性，發(fā)現(xiàn)10個克隆有較強的結合力而不與其它單克隆抗體反應。然后對這10個克隆進行測序。結果表明，所挑選的14個克隆均與單抗2C8有較強的結合性，其中10個克隆能夠發(fā)生較強抑制作用；從所測10個克隆的氨基酸序列分析，“S