姜黃素對內皮祖細胞功能及內皮型一氧化氮合酶的影響.pdf

1、目的：觀察姜黃素對體外培養(yǎng)的人外周血內皮祖細胞(EPCs)功能及內皮型一氧化氮合酶的影響。探索體外擴增內皮祖細胞數量及增強內皮祖細胞功能的藥物方法。 方法：采用密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞(MNCs)。將所得MNCs接種到事先包被纖維連接蛋白的培養(yǎng)瓶里，加入5ml含10％胎牛血清的M199培養(yǎng)液。培養(yǎng)3天后，PBS液洗去未貼壁細胞，貼壁細胞繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換全液，培養(yǎng)第6天的細胞用于實驗。采用標記的乙酰化低密度脂蛋白(D

2、iI-ac-LDL)攝取試驗和荊豆凝集素(FITC-UEA-1)結合實驗，以及CD34、flk-1和Ⅷ因子相關抗原免疫組化染色體外血管形成試驗對內皮祖細胞進行鑒定。 收集內皮祖細胞并分成4組，分別加入姜黃素(0、5、10、15μmol/L)培養(yǎng)一定時間(6、12、24和48h)。分別采用流式細胞儀檢測其數量，CCK-8法檢測增殖能力，培養(yǎng)計數法檢測粘附能力，改良的Boyden小室檢測遷移能力，采用體外血管形成試劑盒檢測EPCs血

3、管生成能力，Griess法檢測NO分泌量及RT-PCR測定eNOS基因表達。所得數據均采用均數±標準差(x±S)表示，組間比較采用T檢驗，單因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05為有顯著差異。 結果： 1.EPCs培養(yǎng)及鑒定 密度梯度離心法分離得到人外周血單個核細胞，培養(yǎng)3天洗去未貼壁的細胞，可以見到典型的細胞集落以及圓形或不規(guī)則形狀的貼壁細胞。典型的集落形態(tài)為：中間為大量的圓形細胞，層層疊疊，外周為梭形細胞，

4、向外放射狀擴散。培養(yǎng)3-7天，絕大多數細胞逐漸分化為梭形細胞，出現條索樣或軌道樣結構。培養(yǎng)7天左右細胞生長至融合狀態(tài)給予傳代處理，20天左右細胞形成典型的鋪路石樣排列，表現為成熟內皮細胞的形態(tài)特點。 流式細胞術鑒定：人外周血單個核細胞培養(yǎng)6天后流式細胞術分析示CD34陽性細胞比例為(73.13±8.51)％，VE-Cadherin陽性細胞比例為(62.65±10.90)％，KDR(VEGFR-2)陽性細胞比例為(7.16±1.3

5、1)％，CD133陽性細胞比例為(5.15±2.15)％，CD34、VE-Cadherin雙陽性細胞比例為(60.17±9.47)％，KDR、VE-Cadherin雙陽性細胞比例為(5.71±0.74)％，CD34、CD133雙陽性細胞比例為(3.87±0.40)％，KDR(VEGFR-2)、CD133雙陽性細胞比例為(4.49±0.55)％。 EPCs雙染色實驗：通過熒光倒置顯微鏡鑒定，吞噬DiI-ac-LDL的細胞激發(fā)紅色熒

6、光，結合FITC-UEA-Ilectin的細胞激發(fā)綠色熒光，為正在分化的EPCs。空白對照組EPCs不顯色。 培養(yǎng)兩周后細胞Ⅶ因子相關抗原免疫組化陽性，胞漿呈棕黃色，一抗以PBS替代的空白對照不顯色，作為對照的胃癌細胞也不顯色。 2、不同濃度姜黃素對體外培養(yǎng)的內皮祖細胞數量及功能的影響 姜黃素與內皮祖細胞體外共培養(yǎng)24小時后實驗顯示：與對照組相比，姜黃素(5、10、15μmol/L)增加外周血EPCs的數量，分別

7、為(50±9)、(60±11)、(85±13)、(125±10)，組間相比有顯著差異(P＜0.01)；改善EPCs的體外增殖能力，分別為(0.841±0.247)、(0.905±0.050)、(0.933±0.119)、(0.950±0.010)，組間相比有顯著差異(P＜0.05)；改善其粘附能力，分別為(30.3±0.5)、(33.6±1.70)、(34.0±2.7)、(36.3±3.50)，組間相比有顯著差異(P＜0.05)；改善其

8、遷移能力，分別為(12.3±0.5)、(13.8±1.5)、(15.8±2.6)、(19.5±3.3)，組間相比有顯著差異(P＜0.01)；促進其體外血管生成能力，分別為(22.2±5.1)、(31.2±2.5)、(40.3±6.5)、(45.1±3.0)，組間相比有顯著差異(P＜0.01)；姜黃素呈時間依賴性促進EPCs來源的NO的釋放(P＜0.01)；并上調eNOS基因表達，與對照組mRNA相比，不同姜黃素組比值分別為(150±5)