辛伐他汀對大鼠心肌細胞鈉氫交換體作用研究.pdf

1、第一部分辛伐他汀對大鼠心肌細胞鈉氫交換體作用研究研究
　　 目的：
　　 辛伐他汀 (simvastatin，SIM) 不僅對慢性心血管疾病的防治有明顯的效果，還能夠顯著減輕缺血再灌注導致的糖尿病小鼠心臟損傷。心肌鈉氫交換體 (Na+/H+exchanger，NHE) 是決定心肌缺血再灌注損傷程度的重要因素。早期的文獻資料表明辛伐他汀能夠降低癌細胞內 pH值，我們最近的研究結果也表明辛伐他汀能夠快速抑制過氧化氫誘導的心肌

2、細胞內 pH和 Ca2+濃度的升高，辛伐他汀預處理能夠阻止過氧化氫誘導的心肌細胞內 pH和 Ca2+濃度的升高，從而抑制過氧化氫誘導的心肌細胞調亡，具體機制不明確。我們的研究設想是辛伐他汀通過抑制心肌細胞鈉氫交換體而實現(xiàn)其對心肌急性損傷的保護作用，本研究將闡明辛伐他汀新的作用機制，以確立他汀類藥物在心肌缺血再灌注損傷、心肌肥厚和心力衰竭防治策略中的地位。
　　 研究方法：
　　 選用原代培養(yǎng)的新生SD大鼠心肌細胞進行實驗

3、。細胞內酸化誘導的：用25mM氯化銨（NH4Cl）處理無碳酸氫鹽的克氏液孵育的心肌細胞3分鐘，緊接著用無Na+的克氏液將NH4Cl沖洗干凈并孵育3分鐘，此時細胞內的NH3快速擴散到細胞外，促使NH4+轉化為NH3而導致細胞內H+增加，細胞內酸化，然后再用含Na+的克氏液替代無Na+的克氏液，此時由于補充了Na+，細胞內酸化可以激活NHE而使細胞內pH得以恢復；應用全波長多功能酶標儀測量系統(tǒng)測定心肌細胞內pH；鈉氫交換體的活性用酸化后從無

4、鈉到有鈉階段每分鐘pH的變化率 (dpHi/dt)表示；有研究發(fā)現(xiàn)細胞外信號調節(jié)激酶 (extracellular regulated protein kinase，ERK)的激活能減少缺血再灌注損傷誘發(fā)的細胞凋亡，用Western blot檢測心肌細胞 ERK的磷酸化(phosphorylated ERK，p-ERK) 水平。
　　 結果：
　　 1.用NHE的抑制劑5-(N-乙基-N-異丙基) 阿米洛利 (5-(N-

5、Ethyl-N-isopropyl) amiloride，EIPA) 5μM，10 μM 作用于無鈉和復鈉階段，與酸化模型組相比，可以使心肌細胞NHE的活性受抑制達102.9％和109.7％ (P>0.05)，辛伐他汀不同濃度組 (10 nM，100 nM，1000 nM) 抑制NHE的作用不明顯,與模型組比較，分別使心肌細胞NHE的活性降低-0.54％，0.16％，0.58％ (P>0.05)，預孵育辛伐他汀 (1000 nM) 10

6、 min，20 min，30 min處理對 NHE的抑制作用也不明顯，與模型組比較，分別使心肌細胞NHE的活性降低0.28％，0.39％，0.31％ (P>0.05)。
　　 2.用25mM氯化銨誘導細胞內酸化模型，在無鈉階段即開始給藥，加入 EIPA (5μM)、辛伐他汀 (100 nM) 各作用于心肌細胞3 min，提取心肌細胞總蛋白，檢測ERK蛋白磷酸化水平的變化。以總的ERK為參照物，與正常對照組比較，無鈉加辛伐他汀組，

7、有鈉加辛伐他汀組以及有鈉加EIPA組分別可以使心肌細胞ERK的磷酸化水平升高186.9％，137.2％，191.3％ (p<0.05)；與有鈉加辛伐他汀組比較，無鈉加辛伐他汀組又高29.3％ (p<0.05)。
　　 3.用25mM氯化銨誘導細胞內酸化模型，在無鈉和復鈉階段均加入EIPA (5μM) 各作用于心肌細胞3 min，提取心肌細胞總蛋白，并檢測酸化模型每一個環(huán)節(jié)中ERK蛋白的磷酸化水平變化。以總的ERK為參照物，與正常

8、對照組比較，無鈉、有鈉和EIPA組分別可以使心肌細胞 ERK的磷酸化水平升高171.4％，118.2％，174.7％ (p<0.05)；與復鈉組比較，無鈉組又高24.4％ (p<0.05)。
　　 結論：
　　 1．辛伐他汀對心肌細胞鈉氫交換體的抑制作用不明顯；
　　 2．細胞內酸化刺激心肌細胞，導致ERK的磷酸化水平升高，其中無鈉克氏液階段比復鈉克氏液階段升高明顯，由此可見，細胞外鈉離子濃度可能與心肌細胞中ER

9、K的調控有關。
　　 第二部分細胞外鈉離子濃度對細胞外信號調節(jié)激酶的影響
　　 研究目的：
　　 由第一部分研究結果得知，細胞外無鈉克氏液和有鈉克氏液對心肌細胞中 ERK的磷酸化水平有差異，所以我們設想細胞外鈉離子濃度與 ERK之間有某種聯(lián)系，我們接下來研究細胞外鈉離子濃度對 ERK的影響。
　　 研究方法：
　　 選用原代培養(yǎng)的新生 SD 大鼠心肌細胞，應用全波長多功能酶標儀測量系統(tǒng)測定心肌細胞

10、內 pH值；鈉氫交換體的活性用細胞酸化之后每分鐘pH值的變化率(dpHi/dt)表示；用 Western blot 檢測心肌細胞 ERK的磷酸化水平。
　　 結果：
　　 1.使用不同鈉離子濃度 (135mM，100 mM，50 mM，25mM，0 mM)直接孵育心肌細胞10min，提取心肌細胞總蛋白，以總的ERK為參照物，與正常對照組相比，分別使ERK的磷酸化水平升高1.84％，6.65％，8.19％，5.56％，8

11、.86％ (p>0.05)。
　　 2.使用不同鈉離子濃度 (135mM，100 mM，50 mM，25mM，0 mM) 恢復酸化之后的細胞，并作用3min，提取心肌細胞總蛋白，以總的ERK為參照物，與135mM比較，100 mM組，50 mM組，25mM組，0 mM組分別使 ERK的磷酸化水平升高13.84％，18.6％，17.27％ (p>0.05)和42.27％ (p<0.05)。
　　 結論：
　　 細

12、胞外鈉離子濃度對ERK的影響不明顯，但在細胞內酸化后細胞外鈉離子濃度則明顯影響 ERK的磷酸化水平。
　　 第三部分細胞內pH值對細胞外信號調節(jié)激酶的影響
　　 研究目的：
　　 由第二部分研究結果得知，雖然在細胞內pH正常時細胞外鈉離子濃度的變化對ERK的磷酸化水平無明顯的影響，但細胞內酸化后，不同的細胞外鈉離子濃度則對ERK磷酸化水平的表達有顯著的影響，在對細胞內酸化后檢測pH值時發(fā)現(xiàn)在無鈉時細胞內pH接近6

13、.67 ,而一旦給與短時間的少量鈉離子 (25mM)，細胞內pH就可以恢復到 7.03，所以我們設想細胞內酸化后不同細胞外鈉離子濃度對ERK的影響是由于細胞內pH 變化所導致的，我們接下來研究細胞內pH值對ERK的影響。
　　 研究方法：
　　 選用原代培養(yǎng)的新生 SD 大鼠心肌細胞，應用全波長多功能酶標儀測量系統(tǒng)測定心肌細胞內 pH值；用 Western blot 檢測心肌細胞 ERK的磷酸化水平。
　　 結果

14、：
　　 1.用不同pH值 (7.2，7.0，6.8，6.6)的高鉀溶液孵育心肌細胞8 min后，并測得此時細胞內外pH值可以達到一致，提取心肌細胞總蛋白，以總的ERK為參照物，與pH值7.2組比較，pH 7.0，6.8，6.6分別使 ERK的磷酸化水平升高5.22％，7.65％ (p>0.05)和33.96％ (p<0.05)。
　　 2.用ERK的抑制劑 U0126 (3 μM) 作用于細胞酸化過程后，提取心肌細

15、胞總蛋白，以總的ERK為參照物，與酸化模型組比較，可以使 ERK的磷酸化水平降低66.48％ (p<0.05)。
　　 3.在克氏液孵育的終末階段，用ERK的選擇性抑制劑 U0126 (3 μM) 預孵育5min并作用于細胞酸化模型的整個過程，與模型組比較，U0126組可以使NHE的活性降低49.46％ (p<0.05)。
　　 結論：
　　 在我們研究的心肌細胞 pHi 范圍 (6.6～7.2) 內，p-ER