基于ROCK通路探討加味五苓散對DBD模型大鼠的預防作用及其機制.pdf

1、目的:
　　本研究在前期文獻研究基礎上，提出用加味五苓散預防性干預STZ誘導下糖尿病神經源性膀胱模型大鼠，從動物行為學、尿動力學、組織形態(tài)學等多角度評價中藥預防性干預糖尿病神經源性膀胱的效應，并借助ROCK信號通道，探討加味五苓散作用糖尿病神經源性膀胱的可能分子機制。
　　方法:
　　1.動物分組與造模:
　　將70只體重約為180-220gSD大鼠隨機分為5組，即空白組10只，模型組、加味五苓散高劑量組、加味五

2、苓散中劑量組、加味五苓散低劑量組各15只。各組大鼠在適應性飼養(yǎng)1周后，糖尿病模型各組大鼠開始進入高脂高糖飼料喂養(yǎng)階段，4周高脂飼料喂養(yǎng)后糖尿病模型各組大鼠予腹腔注射STZ進行糖尿病造模，造模成功后，繼續(xù)喂養(yǎng)8周，直至糖尿病神經源性膀胱大鼠模型自然形成。
　　2.干預措施
　　加味五苓散高、中、低劑量組經體表面積換算分別每日灌胃加味五苓散水煎液6ml、3ml、1.5ml，余下兩組予每日灌服3ml生理鹽水，連續(xù)灌胃8周。

3、　　3.觀測指標
　?、儆^察各組大鼠行為學表現，定期檢測體重、血糖、代謝指標等。第13周時，各組大鼠均進行尿動力檢測，結合體重、血糖、代謝指標和尿動力學等作為判斷糖尿病神經源性膀胱大鼠造模成功以否的重要指標。②尿動力學檢測后取材。將4％多聚甲醛固定過的膀胱組織進行酒精梯度脫水，二甲苯透明，蠟缸浸蠟后進行石蠟包埋，用鋒利刀片將組織蠟塊切成約3-4μ m的切片，進行HE染色，結合HE染色和尿動力學結果對于加味五苓散對糖尿病神經源性膀胱

4、模型大鼠膀胱組織效果進行評價。③進行免疫組化、Western Blot和RT-PCR檢測，結合三種檢測手段對于加味五苓散對于糖尿病神經源性膀胱模型大鼠膀胱組織ROCK通道各蛋白表達影響進行評估。
　　4.統(tǒng)計分析
　　采用SPSS20.0進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數±標準差(±s)表示，組間比較方差齊時采用方差分析;方差不齊時，數據經轉換后方差齊，仍采用方差分析，經數據轉換后方差仍不齊時，采用非參數檢驗。多個不同時點數據

5、比較采用重復測量方差分析，對不滿足協方差矩陣或球形檢驗采用矯正檢驗(Greenhouse-Geisser)方法及兩兩比較，或者采用多元方差分析，檢驗水平α=0.05。
　　結果:
　　1.文獻研究
　?、偬悄虿∩窠浽葱园螂赚F代醫(yī)學研究進展
　　目前學界對于糖尿病神經源性膀胱的發(fā)病機制莫衷一是，比較公認的是認為糖尿病膀胱障礙的出現主要與長期高糖狀態(tài)下導致膀胱組織粘膜、肌層、血管或神經等處病變相關，近幾年糖尿病神經源

6、性膀胱研究的主要突破在于該病病理生理上時間依賴性的發(fā)現，目前針對糖尿病神經源性膀胱發(fā)病機制研究主要集中在膽堿能受體、內皮源性NO、氧化應激作用、神經生長因子等。目前糖尿病神經源性膀胱的現代醫(yī)學治療且以對癥治療為主，未有特效藥物問世，療效尚有待評估。
　?、谔悄虿∩窠浽葱园螂字嗅t(yī)認識
　　通過古代文獻學習得知，糖尿病神經源性膀胱可由多種內外因共同引起，但糖尿病神經源性膀胱的關鍵病機在于腎陽虛所致膀胱氣化不利，因而治療當與溫陽化

7、氣行水為綱。現代醫(yī)家廣泛運用中藥、針灸等中醫(yī)內外治法治療糖尿病神經源性膀胱，但本研究經過對于現有中醫(yī)治療糖尿病神經源性膀胱的文獻得知，無論從治療有效率還是膀胱殘余尿量來看，中醫(yī)對糖尿病神經源性膀胱有確切的療效。但分析文獻可見現有文獻證據質量較低，存在各種偏倚的可能性。而中醫(yī)藥防治糖尿病神經源性膀胱實驗研究非常匱乏，且現有研究的研究質量有待進一步提高。
　?、畚遘呱⒀芯楷F狀
　　五苓散作為仲景千古治水名方，在臨床上得到醫(yī)家廣泛

8、應用，目前研究顯示五苓散可治療內外婦兒各科超過100多種疾病，且五苓散在糖尿病及糖尿病神經源性膀胱的治療中也有確切的療效，筆者通過分析文獻發(fā)現五苓散功不僅僅在于利水，而對人體水液代謝具有潛在雙向調節(jié)作用。
　?、躌OCK通道糖尿病相關性研究
　　多項研究表明ROCK信號通路與糖尿病大血管并發(fā)癥和糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展均密切相關，已成為包括糖尿病神經源性膀胱在內的糖尿病并發(fā)癥防治研究的潛在突破口。
　　2.實驗研究

9、
　　①組間基線
　　第0周時即實驗開始前，各組大鼠體重經統(tǒng)計無顯著性差異(P＞0.05)，說明實驗各組分組均勻，組間基線一致，本次實驗大鼠各組具有可比性。
　?、谔悄虿∩窠浽葱园螂自炷?br>　　從體重來看，模型組大鼠體重較空白組大鼠低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。從血糖來看，經STZ腹腔注射后，模型組大鼠血糖顯著性上升，均值大于16.9 mmol·L-1，與空白組大鼠相比差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

10、提示本次實驗成功復制糖尿病大鼠模型。從代謝指標來看，模型組大鼠的食量、尿量和飲水量均較空白組大，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），可以看出模型組大鼠已出現糖尿病典型的“三多”癥狀。尿動力學結果顯示，與空白組相比，模型組呈現排尿時間延長，順應性增高等特點，兩者相比，具有顯著性差異（P＜0.01）。尿動力學結果提示模型組大鼠逼尿肌功能已經受損。HE染色結果顯示模型組大鼠膀胱組織出現膀胱壁增厚、肌纖維排列紊亂，肌細胞形態(tài)各異，肌束間隙增寬等

11、糖尿病大鼠神經源膀胱典型病理改變，綜合以上結果可認為本次實驗已成功用STZ注射誘導糖尿病神經源性膀胱大鼠模型。
　?、奂游段遘呱㈩A防性干預糖尿病神經源性膀胱效應
　　從血糖來看，中藥各組經糖尿病造模后血糖上升，與空白組大鼠相比差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但與模型組相比無差異（P＞0.05）。因此可以認為加味五苓散對實驗大鼠血糖并沒有產生影響。從代謝指標來看，僅中劑量組食量、尿量和飲水量指標較模型組有改善趨勢，但并沒

12、有顯著性差異（P＞0.05）。尿動力學方面，在中藥各組和模型組相比，中劑量組大鼠在排尿時間和順應性等指標上優(yōu)于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。高劑量組和低劑量組和模型組相比，在排尿時間和順應性等方面有減少的趨勢，但差異均沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）?？烧J為加味五苓散有改善實驗大鼠尿動力指標的作用，但不存在劑量依賴性。HE染色結果來看，中藥干預各組可見部分肌纖維排列較亂，但較模型組相比，肌纖維排列，肌束間隙等病理狀態(tài)均有所改

13、善。鏡下結果表明加味五苓散預防性干預對糖尿病神經源性膀胱大鼠膀胱組織有一定保護和修復作用。
　?、芗游段遘呱τ赗OCK通道影響
　　免疫組化結果顯示，ROCK1和ROCK2蛋白在正常組大鼠膀胱組織肌肉細胞漿中表達，鏡下表現為胞漿部分染色呈棕黃色，這和文獻所記載和抗體說明書基本相符，其中模型組大鼠表達明顯增強，表現為細胞漿棕黃色部分明顯加深，部分呈深棕色，而中藥各組表達均較模型組弱，鏡下圖像表現為細胞漿棕黃色部分較模型組明顯

14、較淺?？梢钥闯黾游段遘呱⒏鹘M在ROCK通道表達上較模型組有所改善，中藥各組之間并不存在明顯差異。
　　Western Blot結果顯示中藥各組有下調表達ROCK1和ROCK2蛋白的趨勢，其中中劑量組可顯著下調ROCK1的表達(P＜0.05)。
　　RT-PCR結果顯示中藥高劑量和中劑量組均有抑制ROCK1mRNA和ROCK2mRNA表達的作用，與模型組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。并顯示出下調MLCKmRNA的趨勢

15、。
　　結論:
　　1，由于發(fā)病機制尚未明確，現代醫(yī)學對于糖尿病神經源性膀胱治療尚無特效的對因治療，現有治療方案療效欠佳，中醫(yī)藥在糖尿病神經源性膀胱防治中有著獨特優(yōu)勢，文獻分析顯示中醫(yī)藥治療糖尿病神經源性膀胱有確切的療效，中醫(yī)藥研究亟需大規(guī)模隨機對照臨床試驗和針對作用機理的實驗研究以提供更高質量循證醫(yī)學證據。五苓散作為千古治水名方，對人體水液代謝具有潛在的雙向調節(jié)作用，高度契合糖尿病神經源性膀胱的生理病理，對于該病的治療具有