MTA1蛋白在乳腺癌患者胸水細胞中的表達、臨床意義及其與RECK蛋白的相關性分析.pdf

1、浸潤、轉移是惡性腫瘤的基本生物學特征，是導致惡性腫瘤患者死亡的關鍵因素。腫瘤轉移相關基因(metastasis-associated gene1，MTA1)是近年發(fā)現的與信號傳導及基因調節(jié)有關的腫瘤轉移相關基因，在多種惡性腫瘤組織中MTA1過表達與腫瘤的浸潤轉移密切相關。
　　基質金屬蛋白酶(MMPs)是一個大家族，因其需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名，是降解細胞外基質的主要酶。MMPs幾乎能降解細胞外基質中的各

2、種蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲轉移中起關鍵作用。
　　RECK(reversion inducing cysterne rich protein with Kazal motifs)是一種新發(fā)現的轉移抑制基因。其機制可能是RECK通過抑制MMP-2、MMP-9及MTI-MMP的分泌活性，從而抑制腫瘤的侵襲和轉移。
　　材料與方法：
　　一、材料
　?。ㄒ唬┡R床資料
　　收集2009年1

3、2月至2012年2月中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院門診及病房乳腺癌胸水患者標本60例（經細胞免疫化學及臨床資料證實為乳腺癌細胞），另外20例乳腺液基細胞包埋蠟塊，共計80例。
　　（二）細胞系
　　一種乳腺正常上皮細胞系MCF-10A和兩種乳腺癌細胞系(MCF-7為低侵襲低轉移癌細胞系，MDA-MB-435s為高侵襲高轉移癌細胞系)購自北京協(xié)和基地醫(yī)學院細胞中心。
　?。ㄈ┲饕噭?br>　　山羊抗人MTA1多克隆抗體購自

4、美國Santa公司，RECK兔抗人單克隆抗體購自美國Santa公司，DAB酶底物顯色試劑盒和S-P超敏試劑盒均購自福州邁新生物技術開發(fā)公司。
　　二、方法
　?。ㄒ唬┟庖呓M織化學技術
　　采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(S-P)法行抗MTA1(1∶100)，RECK(1∶100)免疫組織化學染色。切片常規(guī)脫蠟至水，高溫進行抗原修復，一抗4℃孵育過夜，DAB顯色，蘇木素復染。用PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性乳

5、腺癌切片做陽性對照。
　?。ǘ￤estern blot技術
　　在三種乳腺癌細胞系中檢測MTA1，RECK的蛋白水平?？偟鞍讖募毎抵刑崛。铣曁幚?，4℃靜置，孵育50min，4℃離心20min(800r/min)，提取上清，放入-70℃冰箱里保存。使用前，用Brodford法測定蛋白濃度，以每孔80μg蛋白加入10％SDS-PAGE凝膠電泳后，4℃，50V(MTA1)、100V(RECK)條件下濕電轉移儀將蛋白轉入0

6、.22μmPVDF膜，5％脫脂奶粉封閉液封閉2h，一抗(MTA11∶200稀釋，RECK1∶200稀釋)4℃過夜，X底片曝光，顯影，定影后拍照，以β-actin為內參，用凝膠成像及分析系統(tǒng)(BioImaging Systems，美國)分析蛋白各條帶的灰度值，每組結果均為相同條件重復3次。
　?。ㄈ┙y(tǒng)計學分析
　　應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數據處理:采用x2檢驗（不滿條件時用Fisher確切概率法）分析各組計數資料，采

7、用Spearman等級相關分析MTA1蛋白與RECK蛋白組化表達的關系，采用t檢驗分析Western Blot圖像灰度值，并用LSD-t檢驗對各樣本均數行兩兩比較，采用Pearson相關分析兩指標Western blot結果的相關性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　一、MTA1、RECK在乳腺癌組織中的表達
　　在60例石蠟標本中，MTA1陽性表達40例(66.66％)定位于細胞核，RECK陽性表達2

8、2例(36.66％)主要定位于細胞漿，統(tǒng)計學分析顯示，MTA1蛋白表達與RECK蛋白表達呈負相關，二者的表達與乳腺癌腫塊大小，組織學分級，臨床分期，淋巴結轉移有關。
　　二、MTA1、RECK在乳腺癌細胞系中的表達
　　Western blot檢測，乳腺正常上皮細胞系MCF-10A和乳腺癌細胞系MCF-7，MDA-MB-435s中MTA1蛋白表達水平呈遞增趨勢，而RECK蛋白表達水平則呈遞減趨勢。
　　結論：