人脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與維生素C對(duì)其增殖機(jī)制的研究.pdf

1、目的：⑴探索一種體外高效分離、擴(kuò)增、純化人脂肪干細(xì)胞(Human adipose-derivedstem cells, hADSCs)的方法，并通過(guò)形態(tài)學(xué)、多向誘導(dǎo)分化能力及免疫表型進(jìn)行鑒定，從而建立一套快速、高效、穩(wěn)定的hADSCs培養(yǎng)體系。為hADSCs的后期研究提供充足的細(xì)胞來(lái)源。⑵研究維生素C(Vitamin C，Vc)對(duì)hADSCs體外增值的影響，并初步探索其相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：①收集3例健康人的腹部皮下脂肪組織，

2、通過(guò)改進(jìn)組織塊貼壁法，從脂肪組織中分離出脂肪干細(xì)胞，進(jìn)行體外的擴(kuò)增、純化及觀察其形態(tài)特征;通過(guò)將分離的細(xì)胞進(jìn)行成脂、成骨誘導(dǎo)分化后用油紅O和Von Kossa染色定性鑒定;應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)所分離細(xì)胞的表面抗原。②將Vc作用hADSCs后，CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒檢測(cè)不同時(shí)間的吸光度值并繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn);流式細(xì)胞儀檢測(cè)hADSCs細(xì)胞周期的改變和對(duì)H2O2介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用;間接免疫熒光和Western Blot檢測(cè)P53和Cycli

3、n D1基因表達(dá)的變化。所得數(shù)據(jù)使用SPSS17統(tǒng)計(jì)軟件分析。
　　 結(jié)果：⑴原代及傳代的hADSCs均呈長(zhǎng)梭形或多邊形貼壁生長(zhǎng)，生長(zhǎng)能力旺盛。傳代后的細(xì)胞較快貼壁，迅速進(jìn)入生長(zhǎng)期，5d左右即可進(jìn)行下一次傳代。隨著代數(shù)的增加，其他非ADSCs細(xì)胞逐漸減少，傳代至第3代細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞已相對(duì)純化。⑵經(jīng)成脂和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)后，油紅O染色和Von Kossa染色陽(yáng)性。⑶細(xì)胞表面抗原表達(dá):CD44，CD105，CD29和CD13高表達(dá)。

4、相比之下，CD34，CD31和CD106幾乎沒(méi)有表達(dá)。⑷CCK-8結(jié)果顯示Vc可促進(jìn)細(xì)胞增殖，且40μg/ml的濃度已有明顯的促增殖作用(P＜0.05)。⑸流式細(xì)胞儀分析結(jié)果所示，40μg/ml的Vc作用hADSCs24h后，G1期的細(xì)胞比例呈下降趨勢(shì)，S期和G2期的細(xì)胞比例呈上升趨勢(shì)，各時(shí)相與對(duì)照組比較差異均有顯著性(P＜0.01)。并且Vc能對(duì)H2O2誘導(dǎo)的hADSCs凋亡起到明顯的保護(hù)作用(P＜0.05)。⑹激光共聚焦和蛋白免疫印

5、跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，P53的蛋白表達(dá)水平降低，差異有顯著性（P＜0.05）。而Cyclin D1的蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。
　　 結(jié)論：①建立了一種相對(duì)成熟的hADSCs的體外培養(yǎng)方法，細(xì)胞增殖迅速，狀態(tài)良好，生物學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，無(wú)過(guò)多的非ADSCs的干擾;綜合細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表面抗原標(biāo)志鑒定及成脂誘導(dǎo)和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的結(jié)果可以確定培養(yǎng)細(xì)胞為hADSCs。②Vc對(duì)hADSCs的增殖作用與Vc的濃度有關(guān)，40μ/ml的