痹腫消湯及其有效成分阿魏酸干預膠原誘導性關節(jié)炎大鼠的定量蛋白質組學研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景和目的:類風濕關節(jié)炎(Rheumatiod Arthritis RA)是一種慢性自身免疫性疾病,病情復雜、纏綿、致殘率高。由于發(fā)病機制尚不明確,致使迄今尚無理想的根治藥物,西藥治療以緩解癥狀為主,其單靶點的治療理念在對抗復雜病理機理的時候顯得捉襟見肘。中醫(yī)藥治療RA歷史悠久,積累了豐富的臨床經(jīng)驗,具有多靶點、多環(huán)節(jié)干預的優(yōu)勢。痹腫消湯是導師梁清華教授根據(jù)其多年臨床經(jīng)驗總結的中藥復方,對類風濕關節(jié)炎患者有較好的療效。由于RA的病理機制

2、尚不明確,同時我們也不完全清楚痹腫消湯的作用機制,這直接制約了此復方在臨床中的進一步運用。因此,在本次研究中,我們擬通過定量蛋白質組學方法,在前期研究工作的基礎上進一步探討RA的病理機制及痹腫消湯治療RA的作用機理,并闡明其作用的靶點及干預的信號通路,本研究有助于全面系統(tǒng)的闡明活動期RA發(fā)生發(fā)展的機制及痹腫消湯治療活動期RA的療效分子機理,為臨床上治療活動期RA尋找新的生物效應靶標奠定基礎,為該方治療活動期RA提供新的實驗依據(jù)。

3、  方法:
  1.UPLC-PDA法對白花蛇舌草湯劑中活性成分的定量分析及大鼠灌胃白花蛇舌草湯劑后血清中可吸收成分的定性分析
  中藥的有效成分復雜,從其化學成分入手是以現(xiàn)代化手段研究中藥復方的方法之一。痹腫消湯由多味中藥組成,白花蛇舌草在此方中是君藥。由于白花蛇舌草有抗炎、抗氧化、調節(jié)免疫反應等作用,作為君藥,其對抗RA的作用在此方中具有代表性,因此,我們選擇了痹腫消湯中的君藥白花蛇舌草作為研究對象來初步了解痹腫消湯發(fā)揮

4、治療作用的物質基礎。這里,我們通過超高效液相色譜-光電二極管陣列(UPLC-PDA)法測定白花蛇舌草湯劑中活性成分含量;并同時測定活性成分的標準品,繪制標準曲線,對其精密度、回收率、樣本穩(wěn)定性和重復性進行驗證。對正常SD大鼠灌胃白花蛇舌草湯劑30min后取血,運用UPLC-PDA法對大鼠血清中可吸收的活性成分進行定性檢測。
  2.痹腫消及其活性成分阿魏酸在干預CIA的過程中的抗炎作用研究
  以不同劑量的阿魏酸標準品溶液干

5、預CIA大鼠,用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(ELISA)檢測血清炎性細胞因子IL-1β、TNF-α的含量,得出劑量反應曲線,從而篩選出阿魏酸干預CIA大鼠的最佳劑量。以牛Ⅱ型膠原蛋白混合完全弗氏佐劑全身多點注射于SD大鼠,復制出膠原誘導性關節(jié)炎(CIA)模型。以痹腫消湯劑和最佳劑量的阿魏酸干預CIA大鼠,動態(tài)觀察一般情況、體重增長數(shù)、關節(jié)炎指數(shù)積分、關節(jié)腫脹度、關節(jié)X線攝片及關節(jié)滑膜組織病理學改變,并用ELISA同步檢測各組大鼠血清IL-1β

6、、TNF-α水平。
  3.痹腫消湯及其活性成分阿魏酸干預膠原誘導性關節(jié)炎的定量蛋白質組學研究
  分別提取各組大鼠在28天、42天的滑膜組織,抽提總蛋白,以iTRAQ試劑對不同組的蛋白進行標記,混合,經(jīng)過SCX/RPLC分離,LC-MS/MS鑒定并篩選出各組差異表達的蛋白;通過IngenuityPathway Analysis(IPA)軟件分析這些差異蛋白的生物信息,繪制出信號網(wǎng)絡通路,尋找網(wǎng)絡中與RA發(fā)生發(fā)展密切相關的關

7、鍵性節(jié)點及通路;根據(jù)這些信息闡明RA發(fā)生發(fā)展的病理機制,并在此基礎上進一步探討痹腫消湯及其活性成分阿魏酸的作用機理。
  結果:
  1.UPLC-PDA法對白花蛇舌草湯劑中活性成分的定量分析及大鼠灌胃白花蛇舌草湯劑后血清中可吸收成分的定性分析
  通過UPLC-PDA法,在第8.33、10.61min時,白花蛇舌草湯劑中的活性成分對香豆酸、阿魏酸在色譜圖中獲得良好分離,最大吸收波長分別為308、321nm。兩種成分在

8、其檢測范圍內(nèi)顯示出良好的線性回歸,R2>0.9998、0.9994,其標準品的日內(nèi)、日間精密度良好,其相對標準差(RSD)波動在1.03-3.35%之間;對香豆酸、阿魏酸在白花蛇舌草湯劑中的穩(wěn)定性、重復性良好,RSD波動在1.53-2.41%;同時這兩種成分在湯劑中的加樣回收率良好,平均加樣回收率在97.9%-102.8%之間,RSD波動在1.26-2.41%;經(jīng)UPLC-PDA法檢測后,白花蛇舌草中對香豆酸、阿魏酸的得率為0.527、

9、0.231 mg(有效成分)/g(生藥)。通過UPLC-PDA法,在第8.31、10.46min時,活性成分對香豆酸、阿魏酸在大鼠灌胃白花蛇舌草湯劑后血清中獲得良好分離,最大吸收波長分別為308、321。通過研究對香豆酸、阿魏酸主要色譜峰的特征,SD健康大鼠灌胃白花蛇舌草湯劑30min后,這兩種成分在血清中被成功檢測出。
  2.痹腫消及其活性成分阿魏酸在干預CIA的過程中的抗炎作用研究
  通過不同干預劑量實驗研究發(fā)現(xiàn),劑

10、量3組(1.28mg/kg·d)的阿魏酸在下調CIA大鼠血清IL-1β、TNF-α水平的效果較好,是本實驗中阿魏酸以其抗炎作用干預CIA大鼠的最佳劑量。采用牛Ⅱ型膠原蛋白混合完全弗氏佐劑多點注射SD大鼠的方法,成功復制CIA動物模型。在第14天對模型進行評估,成功率達96%。用上述最佳劑量干預CIA大鼠后:正常組大鼠活潑好動,進食正常;相對于正常大鼠,第14天后,模型組大鼠出現(xiàn)了精神萎靡、少動嗜睡、行動遲緩,飲食減少、關節(jié)紅腫等癥狀,到

11、第28天后,CIA大鼠體重增長比正常大鼠明顯降低,部分大鼠出現(xiàn)關節(jié)腫脹變形、壓痛明顯、活動障礙,甚至雙下肢僵硬癱瘓;相對于模型組大鼠,到第42天時,干預組大鼠行動較活潑,飲食改變不明顯,關節(jié)炎指數(shù)、足爪腫脹較模型大鼠明顯改善(P<0.05),平均體重較模型組大鼠略有上升。另外,通過病理學觀察顯示,與正常大鼠相比,CIA大鼠踝關節(jié)組織中可見大量的炎性細胞浸潤;干預組隨著時間推移炎癥較前逐漸減輕,炎性細胞浸潤程度較前減輕。通過X線攝片發(fā)現(xiàn),

12、與正常組大鼠相比,CIA大鼠踝關節(jié)周圍可見明顯腫脹的軟組織,部分鈣化,關節(jié)間隙模糊、狹窄,甚至消失;干預組大鼠關節(jié)周圍軟組織腫脹程度較模型組降低,關節(jié)間隙狹窄程度較模型組有所改善,但較正常組仍舊狹窄。利用ELISA檢測各組大鼠在第28、42天血清中IL-1β、TNF-α水平發(fā)現(xiàn)模型組炎癥因子水平較正常組明顯上升(P<0.05);而在干預組中,IL-1β、TNF-α平均水平較模型組有所下降(P<0.05)。
  3.痹腫消湯及其活性

13、成分阿魏酸干預膠原誘導性關節(jié)炎的定量蛋白質組學研究
  通過質譜鑒定分析,與正常對照組相比,模型組28d與42d滑膜的共同差異表達蛋白為145個,其中,54個蛋白在模型28天與模型42天均較正常組下調,89個蛋白在模型28d與模型42d均較正常組上調。通過IPA軟件分析發(fā)現(xiàn),這些蛋白共在77個方面發(fā)揮著各自的功能,其中與RA相關的是:在疾病與紊態(tài)方面,參與較多的是結締組織疾病、炎性疾病;在分子與細胞功能方面,參與較多的是細胞集結與

14、組建、細胞間信號交互;在生理系統(tǒng)發(fā)育和功能方面,參與較多的是器官發(fā)育等。這些蛋白共參與了急性期反應、白介素4,7,12傳導與生成、上皮細胞黏附等109條信號通路;根據(jù)這些差異蛋白及信號通路,軟件共繪制出了細胞集結和運行網(wǎng)絡、免疫細胞運動及追蹤網(wǎng)絡、脂質代謝與分子傳輸網(wǎng)絡、骨骼和肌肉紊態(tài)網(wǎng)絡、細胞集結和炎性反應網(wǎng)絡、結締組織發(fā)育和功能紊態(tài)共6個網(wǎng)絡信息圖,通過觀察我們發(fā)現(xiàn),MMP-3、APOE、LIFR、MFGE8、SERBP1等多個蛋白

15、在圖中處于中心位置,為連接信號通路的關鍵性節(jié)點,其異常表達導致相關信號通路與信號網(wǎng)絡變化可能是RA的病理機制之一,有可能成為RA潛在的治療靶點。
  經(jīng)阿魏酸干預后,通過質譜鑒定分析,與模型組相比,阿魏酸干預組在第28天能調節(jié)47個異常表達的蛋白,第42天能調節(jié)37個異常表達的蛋白;在第28、42天均能對10個蛋白逆轉其表達,其中6個蛋白表達下調,4個蛋白表達上調;微管蛋白α-1鏈、40S核糖體蛋白S9、細胞核增殖抗原這3個蛋白在

16、28天和42天均與正常組表達無差異;通過IPA軟件分析發(fā)現(xiàn):阿魏酸干預后發(fā)生改變的所有差異蛋白共參與了Acute Phase Response Signaling等22條可能與類風濕性關節(jié)炎相關信號通路;根據(jù)這些差異蛋白及信號通路,共獲得4個網(wǎng)絡信息圖,分別是:細胞集結與炎性反應網(wǎng)絡、結締組織紊亂與炎性疾病網(wǎng)絡、細胞凋亡與存活網(wǎng)絡、細胞間信號交互網(wǎng)絡。通過觀察我們發(fā)現(xiàn),MFGE8在圖中是連接信號通路的關鍵性節(jié)點;阿魏酸可能通過下調MFG

17、E8等蛋白的表達來調控Acute Phase Response Signaling等信號通路,這可能是阿魏酸湯治療RA的作用機制。
  經(jīng)痹腫消湯干預后,通過質譜鑒定分析,與模型組相比,痹腫消干預組在第28天能調節(jié)152個異常表達的蛋白,第42天能調節(jié)207個異常表達的蛋白;在第28、42天均能對10個蛋白逆轉其表達,其中7個蛋白表達下調,3個蛋白表達上調;α-1肌動蛋白、微管蛋白α-1鏈、肌凝蛋白輕鏈1/3、肌鈣蛋白2、肌凝蛋白

18、4這5個蛋白在28d和42d均與正常組表達無差異;通過IPA軟件分析發(fā)現(xiàn):痹腫消干預后發(fā)生改變的所有蛋白共參與了Actin Cytoskeleton Signaling等57條可能與類風濕性關節(jié)炎相關信號通路;根據(jù)這些差異蛋白及信號通路,共獲得6個網(wǎng)絡信息圖,分別是:免疫細胞運動及追蹤網(wǎng)絡、細胞集結與炎性反應網(wǎng)絡、結締組織發(fā)育和功能紊態(tài)、結締組織紊亂與炎性疾病網(wǎng)絡、細胞功能與運行網(wǎng)絡、細胞間信號交互網(wǎng)絡。通過觀察我們發(fā)現(xiàn),MFGE8、S

19、ERBP1在圖中是連接信號通路的關鍵性節(jié)點;痹腫消湯可能通過下調MFGE8、SERBP1等表達來調控Actin CytoskeletonSignaling等信號通路,這可能是痹腫消湯治療RA的作用機制
  結論:
  1.通過UPLC-PDA法證實對香豆酸、阿魏酸是白花蛇舌草湯劑中的活性成分,并且是大鼠血清可吸收的成分。
  2.痹腫消湯及其活性成分阿魏酸能夠下調CIA大鼠血清中IL-1β和TNF-α水平的作用,緩解膠

20、原誘導性關節(jié)炎大鼠的炎癥反應及關節(jié)炎癥狀,提示阿魏酸可能是痹腫消對抗類風濕性關節(jié)炎的物質基礎之一。
  3.RA的發(fā)病機制與多個蛋白的異常表達及參與的多條信號通路相關,這些信號通路相互作用,形成了復雜的信號轉導網(wǎng)絡。在整個網(wǎng)絡中,多個關鍵性蛋白的異常表達以及多個信號通路的異常變化,使得整個信號轉導網(wǎng)絡異常,這可能是RA的發(fā)病機制之一;痹腫消湯及其有效成分阿魏酸能夠調節(jié)多個異常表達的蛋白,并可能通過調節(jié)這些關鍵蛋白及其相關的信號通路

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