去泛素化酶Ubp5p和植物同源結構域蛋白家族對隱球菌毒力與形態(tài)的調控.pdf

1、第一部分
　　格特隱球菌是臨床上主要的致病真菌之一，多侵犯免疫正常人群，通常會引起肺部感染疾病，而新生隱球菌多侵犯免疫抑制人群，一般會引起腦膜腦炎。雖然格特隱球菌和新生隱球菌歸屬于不同的菌種，其感染所致隱球菌病致死率都非常高。
　　去泛素化在蛋白質修飾中起著至關重要的作用，去泛素化酶主要負責介導泛素的移除和回收，參與調控細胞周期、基因表達等多種細胞活動。在以往的研究中，我們發(fā)現(xiàn)新生隱球菌中去泛素化酶Ubp5的缺失會導致生長缺

2、陷和高溫耐受、莢膜生長和黑色素分泌等毒力顯著下降，提示去泛素化酶Ubp5參與了新生隱球菌生長與毒力的多效性調控。為了探索Ubp5在格特隱球菌和新生隱球菌中作用的不同，我們以格特隱球菌為背景構建了基因UBP5的基因缺陷株，檢測基因UBP5的缺失對格特隱球菌生長、高溫、各種應激應答反應的敏感性和體內毒力的影響。實驗結果顯示格特隱球菌和新生隱球菌的UBP5基因缺陷株R265ubp5Δ和H99 ubp5Δ表現(xiàn)出了一些相似的表型。首先是兩者在營養(yǎng)

3、正常和營養(yǎng)缺乏條件下都表現(xiàn)出了嚴重的生長缺陷。根據(jù)以往的研究我們知道去泛素化酶CnUBP5的同源蛋白Ubp15參與了S.cerevisiae的細胞增殖速率的調控而CnUBP5也相似的調控了某些與細胞周期有關基因的轉錄。新生隱球菌和格特隱球菌UBP5基因相似的生長缺陷引導我們推測去泛素化酶Ubp5可能在格特隱球菌細胞增殖調控中發(fā)揮著與新生隱球菌中相似的作用。基因缺陷株R265ubp5Δ和H99 ubp5Δ表現(xiàn)出相似的高溫敏感性，提示兩個菌

4、種高溫耐受調節(jié)的保守性。以往的研究表明泛素系統(tǒng)在新生隱球菌種參與了抗真菌藥物敏感性的調控，而新生隱球菌和格特隱球菌展示了對抗真菌藥物相似的敏感性。[1]在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)與野生株和回復突變株相比，格特隱球菌中去泛素化酶Ubp5的基因缺陷株對兩性霉素B，氟康唑，氟胞嘧啶，伊曲康唑，特比萘酚和伏立康唑的敏感性都顯著增強。而回復突變株能夠回復表型進一步證實UBP5可能參與了格特隱球菌和新生隱球菌的耐藥機制調控。格特隱球菌基因缺陷株R26

5、5ubp5Δ表現(xiàn)出對細胞壁應激的高度敏感性，這和新生隱球菌的基因缺陷株是一致的。令人意想不到的是，Ubp5對黑色素合成和莢膜生成的影響是完全不同的。在L-DOPA培養(yǎng)基上30℃條件下孵育5天后基因缺陷株C.gattii ubp5Δ黑色素產生比野生株略有增強。在咖啡酸培養(yǎng)基上我們也觀察到了更為顯著的黑色素分泌差異。去泛素化酶基因UBP5的敲除增強了格特隱球菌中莢膜的合成。這些數(shù)據(jù)證明了去泛素化酶Ubp5在格特隱球菌中莢膜和黑色素合成中重要

6、的調控作用。
　　我們分別用小鼠吸入模型和Caenorhabditis elegans模型做了體內毒力實驗，對比了基因缺陷株R265ubp5Δ，野生株和回復突變株毒力的不同。在小鼠吸入模型中，基因缺陷株感染的小鼠能夠存活80天以上，而且肺組織中的真菌負荷量顯著低于野生株，腦組織或脾臟組織甚至沒有發(fā)現(xiàn)酵母細胞的存活。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)在感染后80天內，基因缺陷株感染小鼠肺組織的真菌負荷量是呈下降的趨勢，而且到了第56天肺組織中的酵母

7、細胞已經被完全清除了。與之形成鮮明對比的是，野生株感染小鼠的肺組織真菌負荷量在感染后8周內一直維持在穩(wěn)定的水平。格特隱球菌中的回復突變株能夠完全恢復隱球菌的毒力，這與以往研究中報道的新生隱球菌回復突變株的不完全恢復毒力是不同的。這個實驗結果表明，盡管感染格特隱球菌的患者主要表現(xiàn)為肺部感染，但是格特隱球菌的酵母細胞是可以通過血腦屏障而且存活的。這與既往的研究是相一致的[2]。另外一方面，基因UBP5的敲除也導致了酵母細胞在肺組織完全的清除

8、，這可能最終導致了脾臟和腦組織中真菌負荷量為零。這個結果提示，去泛素化酶Ubp5可能在抑制宿主免疫系統(tǒng)或者介導毒力調控中發(fā)揮著關鍵的作用。
　　綜上所述，我們的研究證實了去泛素化酶Ubp5參與多效調控格特隱球菌的生長與毒力，同時我們通過對比格特隱球菌和新生隱球菌Ubp5基因缺陷株的表型，發(fā)現(xiàn)Ubp5在格特隱球菌和新生隱球菌中調控多種應激應答反應具有相似性，但是對莢膜生成和黑色素合成的影響則差異很大，這進一步證明了兩者在進化上的保守

9、性和差異性，為臨床上更有靶向的研究兩者的致病機制提供了證據(jù)和思路。
　　第二部分
　　除了上述研究的高溫耐受、莢膜等經典毒力，研究證實真菌的形態(tài)對真菌在人體內生存也至關重要。最近研究者發(fā)現(xiàn)新生隱球菌在菌絲相毒力顯著下降，這也和大多數(shù)臨床株以酵母相存在是一致的。為此我們又探索了與酵母相-菌絲相互相轉換機制有關的影響因素。
　　表觀遺傳參與所有真核生物中基因表達等很多細胞活動，研究證明表觀遺傳對菌絲生成具有調控作用[3]。

10、PHD結構域(Plant homeodomain)是一種重要的表觀遺傳控制因子[4]，目前研究主要集中在PHD結構域的結構學分析，對其生物學功能尤其在真菌中鮮有涉及[5]。本研究中我們選擇PHD結構域作為研究表觀遺傳和新生隱球菌酵母相-菌絲相酵母相-菌絲相轉換機制關系的切入點。
　　我們選擇新生隱球菌血清D型JEC21標準株來進行生物信息學研究，主要是因為JEC21注釋比較完善而且是研究有性繁殖和菌絲生長的常用模式菌株。我們首先檢

11、測了PHD基因在真菌細胞生長指數(shù)期的轉錄水平，結果顯示其轉錄水平比內參基因顯著降低，這說明PHD基因在細胞生長過程中可能不起作用或者沒有起到關鍵性的作用，但也不能排除轉錄因子普遍表達水平較低的原因。為了探索PHD基因在有性交配中是否發(fā)揮重要作用，我們檢測了不同配型α和a異性交配過程中PHD基因在不同時間點(0h，3h，10h，24h，48h，72h)的轉錄水平。結果顯示只有PHD4出現(xiàn)表達水平顯著上升，據(jù)此我們可以推測可能PHD4在有性

12、生殖中起到至關重要的作用，可以作為我們研究的重點。
　　為了系統(tǒng)研究這些Phd蛋白在新生隱球菌菌絲生成的調控作用，我們構建了所有PHD基因的缺陷株，然后通過與野生株對比來研究他們在體外應激應答反應和菌絲生成調控中的作用。我們選取XL280作為背景株，因為它是JEC21的直系后代，基因序列具有高度同源性，是近幾年研究新生隱球菌有性生殖和菌絲生成的模式菌株，綜合考慮有利于我們進行生物學分析和實驗設計。
　　我們檢測了所有基因缺陷

13、株對高溫、NO、氧化應激、營養(yǎng)匱乏等體外應激應答反應，結果顯示只有phd3Δ和phd15Δ基因缺陷株具有明顯的生長缺陷。我們又觀察了基因缺陷株對莢膜生成和黑色素合成的影響，比野生株對比，均未發(fā)現(xiàn)明顯異常。綜上所述，我們可以得出，大部分PHD基因不參與以上經典應激應答和毒力因素的調控，因此可以一定程度上排除這些因素對菌絲生成的影響。
　　本課題成員在以往的研究中發(fā)現(xiàn)znf1Δ和phd13Δ基因缺陷株在有性繁殖中菌絲生成增多，為了探究

14、是否是由于PHD結構域功能的缺失導致了菌絲生成增多，我們對所有PHD基因缺陷株進行異性交配和同性交配實驗，觀察在此過程中菌絲生成情況。結果顯示，同性交配過程中，phd2Δ，phd11Δ，phd13Δ和znf1Δ基因缺陷株的菌絲生長顯著增強。說明Phd2，Phd11，Phd13和Znf1對菌絲生成是負向調控的作用，我們推測Phd2，Phd11，Phd13和Znf1蛋白可能參與了同性交配過程中抑制菌絲生長的調控因子表達的激活。異性交配實驗中

15、，我們利用JEC20a與缺陷株（α）交配來檢測基因缺陷株對異性交配過程中菌絲生長的影響。我們選用JEC20a是因為它自生菌絲的能力很弱，因此可以排除自生菌絲對異性交配實驗結果的影響。令人意想不到的是，phd2Δα×JEC20a異性交配中我們觀察到菌絲生成是減弱的，這與我們在同性交配中觀察到的現(xiàn)象完全相反。而對phd13Δandznf1Δ基因缺陷株來說，我們觀察到一個有趣的現(xiàn)象，隨著孵育時間的延長，基因缺陷株同性交配中的菌絲生長比野生株顯

16、著減弱。這個結果引起我們的推測，Phd13和Znf1可能只是在早期階段參與外激素應答的抑制。
　　相比之下，在同性交配和異性交配中基因缺陷株phd3Δ，phd15Δ和phd12Δ都表現(xiàn)出菌絲生成的缺陷。對基因缺陷株phd3Δ和phd15Δ來說，這種菌絲生長缺陷可能是由其生長缺陷造成的，因為在室溫下他們的生長情況也較野生株差很多。Phd12則與之不同，更可能會參與到菌絲生長調控過程。
　　綜上所述，我們的研究證實了植物同源結構