SARS冠狀病毒RNA依賴的RNA聚合酶原核和真核表達(dá)及純化.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、2002年11月至2003年6月,在全球20多個國家和地區(qū)爆發(fā)的嚴(yán)重的急性呼吸道綜合征(Severe Acute Respiratory Syndrome,SARS)是由一種新型的冠狀病毒(coronavirus,CoV)引起的。SARS病毒是全基因組由29,727個核苷酸組成,具有11個開放閱讀框,基因組結(jié)構(gòu)與其它冠狀病毒相似,基因序列與原先發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒的同源性不高,被列為冠狀病毒科的新類型。其編碼的蛋白質(zhì)推測有23種,但對感染患病

2、起重要作用的可能是5種關(guān)鍵蛋白:E蛋白、S蛋白、M蛋白、N蛋白、蛋白酶復(fù)合體,蛋白酶復(fù)合體分成14個蛋白,其中包括RNA依賴的RNA聚合酶(RNA Dependent RNA Polymerase,RDRP)。 SARS病毒的蛋白酶復(fù)合體編碼區(qū)占基因組序列長度的2/3,相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在翻譯時利用特有的核糖體移框(ribosomal frame shifting)機制產(chǎn)生兩個大小不同的ORF1ab和ORF1b編碼框編碼木瓜水解蛋

3、白酶(papain—like proteinase,PLPpro)和3C樣胰凝乳酶(3C—like proteinase,3CLpro),二者可自身水解消化成16個成熟的復(fù)制酶蛋白(亦非結(jié)構(gòu)蛋白,nonstructural protein,nsp)。通過一系列生物信息學(xué)BLAST比對,在此16個非結(jié)構(gòu)蛋白中發(fā)現(xiàn)RNA依賴性聚合酶(RDRP,nsp12)存在高度保守的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域,并且?guī)缀跛械恼淩NA病毒都編碼有RNA依賴的RNA聚合酶

4、,其中GDD基序高度保守的,可能與酶的催化功能相關(guān)。冠狀病毒復(fù)制酶蛋白的合成是病毒在細(xì)胞中生命活動的開始,復(fù)制酶蛋白復(fù)合體及其水解產(chǎn)物對于病毒基因組的復(fù)制、亞基因組的轉(zhuǎn)錄以及翻譯后的調(diào)節(jié)起到重要作用,而目前這種分子機制仍不清晰。 本課題包括的研究內(nèi)容有:1)首先利用兩對引物從SARS—CoV cDNA擴增出RDRP基因的全長,分別克隆入真核表達(dá)載體pCMV—Myc和原核表達(dá)載體pGEX4T—1。2)真核表達(dá)RDRP蛋白并研究其細(xì)

5、胞定位。3)原核誘導(dǎo)GST—RDRP融合蛋白,并純化此蛋白,為了進一步研究RDRP蛋白的功能做準(zhǔn)備。4)利用PCR定點突變技術(shù)將GDD突變?yōu)锳DD,即將甘氨酸突變?yōu)楸彼幔?gòu)建突變ADD的真核和原核表達(dá)載體pCMV—Myc—M-Pol and pGEX—4T—1—M-Pol。5)原核誘導(dǎo)突變型GST—RDRP融合蛋白,并純化此蛋白,為下一步比較野生型和突變型GST—RDRP體外合成RNA的功能作準(zhǔn)備。 本實驗中,通過pCMV—

6、Myc-Pol轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,用Western—blot方法檢測到其成功表達(dá),并在共聚焦顯微鏡下觀察蛋白在293細(xì)胞的定位;通過構(gòu)建pGEX4T—1-Pol和pGEX4T—1—M-Pol,在大腸桿菌中成功地誘導(dǎo)了帶有GST標(biāo)簽的野生型和突變型重組蛋白,誘導(dǎo)表達(dá)后純化得到野生型和突變型GST—RDRP重組蛋白。 結(jié)論:成功構(gòu)建的真核表達(dá)載體,在真核細(xì)胞中過表達(dá)的RDRP蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)。成功構(gòu)建表達(dá)突變型和野生型RDRP融合蛋

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