酮康唑、特比萘芬聯(lián)合中藥單體抗馬拉色菌的實驗研究.pdf

1、馬拉色菌是人體和其他溫血動物皮膚表面的正常菌群，與花斑癬、馬拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎、特應性皮炎等皮膚病有關。自1889年Baillon首次提出馬拉色菌的概念以來，其命名和分類經歷了一個長期的演變過程，直到20世紀90年代中期，人們基于形態(tài)學、超微結構、生理生化特征以及分子生物學的研究，將馬拉色菌分為糠秕馬拉色菌(M.furfur)、球形馬拉色菌(M.globosa)、鈍形馬拉色菌(M.obtusa)、厚皮馬拉色菌(M.pachyder

2、matis)、限制性馬拉色菌(M.restricta)、斯洛菲馬拉色菌(M.slooffiae)和合軸馬拉色菌(M.sympodialis)等7個種進一步認識到由于馬拉色菌各菌種的生理生化特征的不同，其對抗真菌藥物的敏感性亦存在差異。近年來，國外學者針對馬拉色菌的新分類法進行了為數不多的藥敏實驗研究。 隨著馬拉色菌相關皮膚病如花斑癬，馬拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎、特應性皮炎等逐漸被人們所認識，因其病譜廣，患者眾多，開發(fā)高效低毒的抗

3、馬拉色菌藥物就顯得尤為重要。而化學合成一種新的抗真菌化合物，周期長耗費人力物力巨大，我國中醫(yī)中藥對真菌感染的治療歷史悠久，積累了豐富經驗，因此從中草藥及其提取物中篩選出具有抗馬拉色菌作用的藥物，并與西藥聯(lián)合應用，不僅降低化學合成藥物的治療量，而且還可減低其不良反應，增強殺菌效果并防止耐藥發(fā)生。該研究在此方面進行了一些初步探索。 國內外關于中草藥抗馬拉色菌的相關報道較少，國內羅東輝等報道了用肉桂醛和茴香醛抗糠秕孢子菌的研究，杜青云

4、等報道了姜黃揮發(fā)油洗劑對糠秕孢子菌的抑菌實驗研究，朱敏等報道了23種中草藥及14種單體抗馬拉色菌的體外藥敏研究。國外Hammer和Weseler等報道了茶樹油抗馬拉色菌的實驗研究。在國內外為數不多的馬拉色菌體外藥敏實驗報道中表明酮康唑、特比萘芬對馬拉色菌均較敏感。 目的 1、對院門診收集到的馬拉色菌臨床分離株進行菌種鑒定，觀察來自于不同病源的馬拉色菌菌種的構成比是否存在差異。 2、通過體外藥敏實驗篩選出對馬拉色菌

5、抑菌作用較好的中藥單體，并將其與酮康唑、特比萘芬分別聯(lián)合用藥，觀察中西藥聯(lián)合用藥對馬拉色菌的體外抑菌作用。 3、將篩選出的對馬拉色菌抑菌作用較好的中西藥聯(lián)合用藥，通過電鏡和流式細胞儀的檢測，從細胞、亞細胞水平研究中西藥聯(lián)合用藥對馬拉色菌的抗菌機制和抑菌作用。 4、通過動物實驗觀察中西藥聯(lián)合用藥對皮膚馬拉色菌感染的體內抑菌作用。為開發(fā)高效低毒的抗馬拉色菌藥物提供理論依據。 方法 1、對從花斑癬、馬拉色菌毛囊

6、炎、脂溢性皮炎、頭皮屑和正常人頭及額部來源的108株馬拉色菌通過生理生化特性及形態(tài)學特征進行鑒定，觀察各菌種與各種皮膚病的關系。 2、參考美國國家臨床實驗室標準化委員會(NCCLC)制訂的M27-A方案中酵母菌微量稀釋法，對8種中藥單體苦參堿，氧化苦參堿、麝香草酚、丁香酚、鹽酸小檗堿、黃芩昔、丹皮酚、肉桂酸進行抗馬拉色菌的體外藥敏實驗，從中篩選出對馬拉色菌抑菌作用較好的中藥單體，將其分別與酮康唑、特比萘芬聯(lián)合用藥，觀察中西藥聯(lián)合

7、用藥對馬拉色菌的體外抑菌作用。 3、通過透射電鏡觀察聯(lián)合用藥和兩藥單獨應用對馬拉色菌作用12h、24h時的抑菌作用及作用機制。 4、通過流式細胞儀檢測聯(lián)合用藥及兩藥單獨應用對馬拉色菌作用12h、24h時對其細胞周期的影響。 5、通過動物實驗觀察中西藥聯(lián)用對皮膚馬拉色菌感染的抑菌作用，該文首先構建了豚鼠皮膚馬拉色菌感染的模型，然后采用自身對照法，比較了在豚鼠皮膚馬拉色菌感染后用藥的第4天和第7天，3個實驗組(聯(lián)合用

8、藥組及兩個單獨用藥組)和2個對照組(陰性對照組及空白對照組)皮損處真菌菌落形成單位(CFU)的不同。 結果及結論 該研究共分五部分，分別從體外藥敏實驗，細胞、亞細胞水平研究及體內動物實驗對中西藥結合抗馬拉色菌的作用進行了探討。 1、從花斑癬、馬拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎、頭皮屑和正常人頭及額部分離出108株馬拉色菌通過對其生理生化特性及形態(tài)學特征鑒定出5個種，分別是M.sympodialis(32株)，M.furf

9、ur(19株)，M.globosa(47株)，M.obtusa(3株)，M.restricta(7株)，并經多樣本間兩兩比較Cochran-Mantel-HaeuszelStatistics檢驗，統(tǒng)計學分析表明，不同皮膚病中馬拉色菌菌種構成有差異性，該文從花斑癬病人中分離的馬拉色菌以M.sympodialis較多，其次為M.furfur,從馬拉色菌毛囊炎中分離出的馬拉色菌以M.globosa為主要菌種。 2、參考美國國家臨床實驗

10、室標準化委員會(NCCLS)制訂的M27-A方案中酵母菌微量稀釋法，對8種中藥單體苦參堿，氧化苦參堿、麝香草酚、丁香酚、鹽酸小檗堿、黃芩苷、丹皮酚、肉桂酸中篩選出4種中藥單體(苦參堿、氧化苦參堿、麝香草酚、丁香酚)對M.globosa(CBS7966)抑菌作用較好，然后將酮康唑、特比萘芬分別與麝香草酚、丁香酚組合成4種聯(lián)合用藥，對7種馬拉色菌標準株進行體外藥敏實驗，篩選出酮康唑和麝香草酚的聯(lián)合用藥及特比萘芬與丁香酚的聯(lián)合用藥對馬拉色菌的

11、抑菌作用較好。然后將這2種聯(lián)合用藥對40株馬拉色菌臨床分離株用棋盤微量稀釋法進行體外藥敏實驗，經統(tǒng)計學分析表明，酮康唑和麝香草酚聯(lián)合用藥及特比萘芬與丁香酚聯(lián)合用藥對馬拉色菌具有協(xié)同抑菌作用的百分比分別為87.5％、52.5％，二者經Fisher'sexacttest，P=0.001，表明差異有顯著性。 3、通過透射電鏡觀察酮康唑、麝香草酚單用和聯(lián)合用藥對球形馬拉色菌作用12h、24h時其細胞超微結構的變化情況，實驗結果表明麝香草

12、酚對球形馬拉色菌的作用位點可能在細胞壁或細胞膜，酮康唑和麝香草酚兩藥聯(lián)合應用比單獨應用抑菌作用明顯，其超微結構的改變與藥物作用時間呈正相關。 4、通過流式細胞儀檢測酮康唑和麝香草酚聯(lián)合用藥及兩藥單獨應用對球形馬拉色菌作用12h和24h時對其細胞周期的影響，實驗結果表明，在12h時球形馬拉色菌S期及增殖指數PI％，聯(lián)合用藥組＞麝香草酚組＞酮康唑組，在24h時球形馬拉色菌S期及增殖指數PI％，聯(lián)合用藥組＜麝香草酚組＜酮康唑組，經多樣

13、本間兩兩比較Cochran-Mantel-HaeuszelStatistics檢驗，統(tǒng)計學分析3組用藥在不同的時間點均有統(tǒng)計學差異，表明藥物在作用一定時間后才能對球形馬拉色菌產生抑菌作用，使其DNA合成受抑制，增殖活性減低，酮康唑與麝香草酚聯(lián)合用藥抑菌作用優(yōu)于二者單獨用藥。 5、通過動物實驗進一步觀察酮康唑和麝香草酚聯(lián)合用藥在體內的抑菌作用，該文首先構建了豚鼠皮膚馬拉色菌感染的模型，然后采用自身對照法，比較了在酮康唑和麝香草酚聯(lián)

14、合用藥和單獨用藥第4天和第7天時，皮損處真菌菌落形成單位(CFU)，經多樣本間兩兩比較Cochran-Mantel-HaeuszelStatistics檢驗，統(tǒng)計學分析表明在用藥第4天時酮康唑和麝香草酚聯(lián)合用藥組與麝香草酚單獨用藥組及兩個對照組相比，有統(tǒng)計學意義。在用藥第7天時，酮康唑組和麝香草酚聯(lián)合用藥與兩藥單獨應用組及兩個對照組相比均有統(tǒng)計學意義。進一步證實了體外藥敏實驗的結果即酮康唑和麝香草酚聯(lián)合用藥對馬拉色菌的抑菌作用優(yōu)于兩藥單