偽狂犬病毒lncRNA轉錄組測序和lncRNA在神經細胞中的表達.pdf

1、長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，lncRNA）是一類長度大于200 bp且不具有編碼功能的轉錄本。在真核細胞中，長鏈非編碼RNA的主要通過以下幾種方式實現(xiàn)其功能:作為誘餌阻止蛋白質和核酸等物質與其相對應的底物結合;作為骨架與其他物質形成相關的復合物;作為向導將相關的物質定位到細胞中特定的位置。通過這些調控方式，長鏈非編碼RNA參與真核生物細胞的復制、生長、分化、凋亡等過程，從而影響生物個體的生長發(fā)育、表觀遺傳、免

2、疫反應和自身相關的疾病。
　　偽狂犬病毒(Psedorabies virus，PRV)是皰疹病毒科α皰疹病毒亞科的成員之一。每年該病毒的感染給世界生豬養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經濟損失。PRV在感染天然宿主時具有噬神經性和潛伏感染性。當PRV在宿主的中樞神經系統(tǒng)中建立潛伏感染時，病毒在基因ep0和ie180之間的DNA序列編碼了數(shù)條潛伏感染相關的轉錄本（Latency associated transcripts，LATs），這些潛伏感染相

3、關的轉錄本都屬于lncRNA，且在PRV感染的上皮細胞中部分潛伏感染相關的lncRNA能夠以較低的豐度表達。因此，PRV感染上皮細胞時可能編碼未知的lncRNA，且這些lncRNA可能在病毒的感染、復制、神經細胞侵入和潛伏感染等過程中發(fā)揮重要的功能。
　　大部分lncRNA與真核生物的mRNA結構相似，都具有5'端的帽子結構和3'端的ploy(A)結構，但有部分lncRNA不具有ploy(A)結構。因此，在鏈特異性文庫構建過程中，

4、為了盡量獲得病毒編碼的各種RNA，我們用隨機引物代替oligo-dT對RNA進行反轉錄。利用高通量測序技術對文庫進行測序，同時結合生物信息學方法分析病毒和宿主表達的lncRNA。隨后通過northern blot、RT-PCR和3'RACE驗證病毒和宿主編碼的lncRNA，并且利用序列比對和RT-CR證明PRV編碼的lncRNA在不同毒株之間具有保守性。此外，當PRV感染雞原代背根神經節(jié)(Dorsal root ganglion，DRG

5、)細胞時，病毒編碼的lncRNA能夠在神經細胞中表達。而且病毒感染的時間、感染劑量和細胞的培養(yǎng)方式都能影響PRV編碼的lncRNA在神經細胞中的表達。在上皮細胞中，我們利用siRNA干擾病毒lncRNA的表達，結果表明部分lncRNA能夠抑制病毒的復制。因此，該研究能夠為lncRNA在PRV潛伏感染過程中的功能提供理論基礎和新的思路。本研究的主要工作內容如下:
　　1.PRV lncRNA轉錄組測序及分析
　　PRV以1 M

6、OI的劑量感染PK-15細胞，24 h后提取細胞的總RNA，同時對提取的RNA進行質量檢測。隨后構建鏈特異性文庫，利用Illumina Hiseq2500測序平臺對文庫進行測序。隨后去掉測序數(shù)據(jù)中質量較低的數(shù)據(jù)，通過生物信息學方法分析病毒和宿主編碼的lncRNA。我們總共鑒定了28262個lncRNA，其中發(fā)現(xiàn)3條病毒編碼的lncRNA，其余的28259條lncRNA均為宿主自身編碼的lncRNA。在宿主編碼的lncRNA中，28224

7、條lncRNA是新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，剩余的35條lncRNA已經被報道。
　　2.LncRNA的鑒定
　　首先將PRV Ea株病毒感染PK-15細胞，利用RT-PCR分別驗證病毒和宿主編碼的lncRNA。同時利用RT-PCR驗證PRV編碼的lncRNA在PRV Bartha株、HNX株和SMX株之間具有保守性。為了進一步驗證病毒和宿主編碼的lncRNA，我們利用northern blot檢測到1條病毒編碼的lncRNA以及

8、利用3'RACE獲得1條病毒編碼的lncRNA的3味端序列。
　　3.PRV編碼的lncRNA在神經細胞中的表達
　　我們選取10日齡的SPF雞胚分離雞胚DRG神經細胞，并將細胞分別接種到細胞培養(yǎng)皿和微流體中，細胞培養(yǎng)至一個星期時即可獲得成熟的神經細胞。為了驗證PRV編碼的lncRNA是否能夠在神經細胞中表達，我們用PRV Ea株病毒感染細胞培養(yǎng)皿中的成熟的神經細胞，RT-PCR和qPCR結果顯示PRV編碼的3條lncRNA

9、能夠在神經細胞中表達，且病毒感染的時間和劑量能夠影響病毒lncRNA的表達。對于培養(yǎng)在微流體中的神經細胞，當神經細胞成熟后，我們向神經細胞的軸突端接種PK-15細胞，構建PRV神經細胞入侵模型和PRV激活感染狀態(tài)時上皮細胞入侵模型。RT-PCR和qPCR結果表明不同培養(yǎng)方式的細胞能夠影響病毒lncRNA的表達。
　　4.PRV編碼的lncRNA對病毒復制的影響
　　根據(jù)病毒lncRNA的序列，我們分別設計相應的siRNA干擾

10、病毒編碼的lncRNA在PK-15細胞中的表達。通過對干擾后的病毒滴度進行分析，發(fā)現(xiàn)2條病毒編碼的lncRNA被siRNA干擾后顯著性地促進病毒的復制。
　　總的來說，我們的研究結果揭示在PRV感染宿主細胞的過程中，病毒自身除了能夠編碼lncRNA外，同時還能夠引起宿主細胞lncRNA的表達。病毒編碼的lncRNA在神經細胞中同樣具有較高的表達豐度，而且在不同培養(yǎng)方式的神經細胞中，病毒編碼的lncRNA的表達量也不同。部分病毒自身