坦布蘇病毒NS5蛋白單克隆抗體的制備與鑒定及快速檢測(cè)膠體金試紙條方法的建立.pdf

1、2010年春夏之交，我國(guó)江浙和山東等地區(qū)均報(bào)道了以一種引起鴨產(chǎn)蛋率大幅下降、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、卵巢出血為主要癥狀的急性傳染病，之后廣泛傳播到我國(guó)的大部分地區(qū)，并給蛋鴨的養(yǎng)殖業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。感染鴨群主要表現(xiàn)為采食量和產(chǎn)蛋量的急速下降，依照發(fā)病的日齡不同，死亡率為5％～10％之間。經(jīng)過(guò)國(guó)內(nèi)多個(gè)試驗(yàn)室的診斷和病毒的分離，可以確定該病是由黃病毒引起的，隸屬黃病毒屬(Flavivirus)、恩塔亞病毒群(Ntaya virus group)的

2、鴨坦布蘇病毒(duckTembusu virus，DTMUV)。研究坦布蘇病毒蛋白的結(jié)構(gòu)功能及建立快速檢測(cè)方法，是控制該病的有效措施。本研究建立了快速檢測(cè)坦布蘇病毒的膠體金檢測(cè)方法，成功地制備了抗坦布蘇病毒NS5蛋白的單克隆抗體，為防治該病提供了技術(shù)支持。本研究?jī)?nèi)容分為以下兩個(gè)部分:
　　1.坦布蘇病毒NS5蛋白單克隆抗體的制備
　　本研究利用本試驗(yàn)室構(gòu)建的PET-28a+NS5原核表達(dá)載體，成功轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21細(xì)胞，

3、并純化產(chǎn)生的坦布蘇病毒NS5蛋白。利用純化的NS5蛋白免疫6-8周齡的BALB/c小鼠，經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合、間接ELISA篩選和有限稀釋亞克隆法獲得了3株穩(wěn)定分泌針對(duì)坦布蘇病毒NS5蛋白的單克隆抗體A4D1、B4B8和C12D2，并對(duì)A4D1和B4B8進(jìn)行相關(guān)特性鑒定。經(jīng)ELISA效價(jià)測(cè)定，兩株單抗的細(xì)胞上清效價(jià)均為1∶100，誘導(dǎo)產(chǎn)生腹水的效價(jià)分別為1∶128000和1∶64000。間接ELISA結(jié)果表明，兩株單抗只與DTMUV反應(yīng)，無(wú)交叉

4、反應(yīng)性。Western blot和IFA結(jié)果表明，兩株單抗均可與體外純化的NS5蛋白以及坦布蘇病毒發(fā)生特異性反應(yīng)?？固共继K病毒NS5蛋白單克隆抗體的成功研制，為坦布蘇病毒的免疫學(xué)診斷及致病機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。
　　2.坦布蘇病毒膠體金檢測(cè)試紙條方法的建立
　　利用試驗(yàn)室保存的抗坦布蘇病毒E蛋白單克隆抗體A12D3為金標(biāo)抗體，制備的鼠抗E蛋白多克隆抗體為包被抗體，建立了雙抗體夾心膠體金試紙條檢測(cè)坦布蘇病毒的方法。用該試紙條可特