NF-κB特異的RNAi腺病毒載體的構建及其對血管內皮細胞增殖凋亡的影響.pdf

1、目的：構建針對NF-κB p65基因的RNAi腺病毒表達載體，從轉錄后水平抑制p65基因表達，為研究NF-κB信號通路提供技術工具；并利用構建的RNAi腺病毒感染血管內皮細胞，抑制．p65表達，觀察NF-κB信號通路對血管內皮細胞增殖和凋亡的影響。 方法：設計合成三對針對p65 mRNA不同位點的shRNA編碼序列，克隆到腺病毒穿梭質粒中，然后通過體外同源重組構建重組。RNAi腺病毒表達載體；在HEK293A細胞中包裝并擴增病毒

2、、空斑實驗法進行病毒滴度測定，獲得高滴度的病毒上清；腺病毒感染血管內皮細胞ECV304株，Western Blot和免疫細胞化學法檢測構建的RNAi腺病毒對p65表達的抑制效果，并探討不同的感染復數(shù)(MOI值)及病毒感染后不同時間對p65抑制效應的影響；利用RNAi腺病毒抑制1965表達，探討NF-κB信號通路對ECV304細胞增殖和凋亡的影響。 結果：1．成功構建了針對p65基因三個不同位點的RNAi腺病毒表達載體，經PCR和

3、測序鑒定干擾片段的堿基序列及插入位點完全正確；2．在HEK293A細胞中包裝、擴增腺病毒，獲得高滴度腺病毒上清；測定擴增第二代的病毒液滴度在3.0×10<'9>pfu～2.5×10<'10>pfu之間，可滿足后續(xù)實驗需要；3．構建的三個RNAi腺病毒感染ECV304細胞后均可使p65表達量明顯下降，RNAi腺病毒MOI值15～25即可以實現(xiàn)對ECV304細胞p65表達的有效抑制；4.RNAi腺病毒感染ECV304細胞后48h開始檢測到p

4、65表達量下降，且隨時間延長p65表達量進一步減少，抑制效應可持續(xù)六天以上；5．腺病毒感染ECV304細胞3d、5d、7d后MTT檢測，RNAi腺病毒組與空病毒組相比，細胞增殖率明顯下降(p<0.05或p<0.01)：但流式細胞檢測結果提示對ECV304細胞凋亡的影響不明顯。 結論：構建NF-κB p65特異的RNAi腺病毒表達載體能有效抑制p65基因的表達，可以作為研究NF-κB信號通路的重要技術手段；NF-κB信號通路對正常