大腸癌中IGF2的印跡丟失與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系.pdf

1、目的：采用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RT-PCR—RFLP)方法，研究大腸癌中IGF2基因印跡狀態(tài)的改變，分析印跡基因IGF2的印跡丟失與大腸癌的關(guān)系，探討IGF2的印跡丟失在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的印跡調(diào)控機(jī)制，并探討其與大腸癌生物學(xué)行為的關(guān)系。 方法：收集56例人原發(fā)性大腸癌患者原發(fā)灶和癌旁組織標(biāo)本。1.組織DNA/RNA提取和鑒定取約100mg凍存組織標(biāo)本，常規(guī)用10％SDS/氯仿/乙醇法提取DNA。紫外分光光

2、度法測(cè)定A260/A280，DNA樣品的比值為1.8—2.0為最佳。TRIZOL試劑/氯仿/異丙醇/乙醇提取RNA。2.IGF2第九外顯子內(nèi)有一 ApaⅠ多態(tài)酶切位點(diǎn)，只有當(dāng)標(biāo)本的基因型為雜合狀態(tài)時(shí)，才能為區(qū)分兩條等位基因的表達(dá)產(chǎn)物提供信息。3.選擇雜合子標(biāo)本，對(duì)其RT-PCR產(chǎn)物用相同的內(nèi)切酶切，酶切后經(jīng)12％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。如果IGF2的基因表達(dá)呈雙等位基因表達(dá)型(AB型)即292bp和256bp同時(shí)存在，說(shuō)明發(fā)生了印跡丟

3、失。如果只出現(xiàn)292bp條帶(A型)或出現(xiàn)256bp(B型)，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄來(lái)自于一條等位基因，即維持正常印跡狀態(tài)。4.采用Fisher確切概率法分析IGF2印跡丟失與臨床病理資料的相關(guān)性。所有數(shù)據(jù)均用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析。 結(jié)果：1.PCR產(chǎn)物檢測(cè)。產(chǎn)物為292bp，通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)液的瓊脂糖凝膠電泳后圖像分析，以成功合成產(chǎn)物。2.雜合標(biāo)本的篩選。56例待測(cè)標(biāo)本中，共篩出29例IGF2雜合標(biāo)本，其陽(yáng)性率為51.79％(29/

4、56)。其中雜合丟失1例。3.印跡狀態(tài)檢測(cè)。雜合標(biāo)本的正常組織反轉(zhuǎn)錄的cDNA，經(jīng)PCR后，再經(jīng)ApaⅠ酶切后用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，在28例無(wú)雜合性丟失的雜合子中，有17例(60.71％)腫瘤組織發(fā)生了LOI。在這17例腫瘤組織對(duì)應(yīng)的癌旁組織中，有14例(82.35％)發(fā)生了LOI，另外3例沒(méi)有LOI。腫瘤組織和癌旁組織均無(wú)印跡丟失的有7例(25％)。4.IGF2的LOI與臨床病理特征的關(guān)系。28例有意義的樣本中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有13

5、人，發(fā)生LOI的有11人；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的15人，發(fā)生LOI的有6人。IGF2的LOI與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性(P<0.05)，與腫瘤患者的年齡，性別，腫瘤發(fā)生的部位均無(wú)關(guān)(P>0.05)。 結(jié)論：大腸癌組織和癌旁正常組織均出現(xiàn)LOI，發(fā)生LOI的腫瘤組織病例中癌旁組織LOI發(fā)生率明顯高于未發(fā)生LOI的腫瘤組織病例中癌旁組織出現(xiàn)LOI的發(fā)生率。兩者相比有顯著性差異(P<0.05)。IGF2基因的LOI與臨床病理學(xué)特征(年齡，性別，發(fā)