N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶-V與前列腺癌惡性生物學行為的關系.pdf

1、一、研究背景:
　　 生物體內的大多數蛋白質都以糖蛋白的形式存在，細胞膜上的糖蛋白糖鏈結構與腫瘤的粘附、入侵及轉移密切相關。N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶(N-acetylglucosaminyl-transferase-V,GnT-V)為糖蛋白N-糖鏈加工酶之一，起著決定N-糖鏈類型及復雜型糖鏈結構的重要作用，主要分布在高爾基體中，能催化形成N-糖鏈的β-1,6分支，β-1,6-N-乙酰氨基葡萄糖分支在腫瘤組織含量豐富，與腫瘤的轉移

2、、惡性轉化等生物學活性密切相關。GnT-V影響腫瘤生物活性主要是通過改變細胞表面糖蛋白如鈣黏蛋白、整合素及細胞表面生長因子受體的β-1,6分支結構。另外分泌型GnT-V在腫瘤細胞外基質中有一種引起腫瘤血管生成的新功能，而且與糖基轉移酶催化活性無關。GnT-V活性在許多惡性腫瘤組織中表達增高，如乳腺癌、結腸癌和肝癌。人乳腺癌細胞系中，GnT-V表達與腫瘤的大小成正相關;高轉移結腸癌細胞株中，GnT-V活性與腫瘤侵襲轉移能力成正相關。然而，

3、在非小細胞肺癌和膀胱癌中，GnT-V的表達量越低，腫瘤的惡性程度反而越高。因此，GnT-V在不同腫瘤中的作用是不一樣的。
　　 前列腺癌是泌尿生殖系最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病隨年齡而增長，其發(fā)病率有明顯的地區(qū)差異，歐美地區(qū)較高。據報道僅次于肺癌，在男性是癌癥死亡的第二位。前列腺癌主要治療手段有根治性手術和內分泌治療、放療及化療。根治術后復發(fā)、發(fā)生遠處轉移及無法耐受手術的患者多選擇內分泌治療。接受內分泌治療的患者，大多數起初有效，

4、但經過中位時間14～30個月后，幾乎都將逐漸發(fā)展為激素非依賴性前列腺癌或激素難治性前列腺癌。如何有效地治療激素非依賴性前列腺癌或激素抵抗性前列腺癌依然是基礎和臨床研究的熱點和難點?；煶Ｓ糜诩に胤且蕾囆郧傲邢侔珜颊叩闹委熜Ч杂邢?。而放射治療可對局限性前列腺癌進行根治性放療，也可作為手術治療的輔助治療和晚期患者的姑息性治療。但臨床發(fā)現部分病人因放療抵抗導致放療后局部復發(fā)，以致患者預后不佳。已經發(fā)現的和前列腺癌細胞放射敏感性有關的預

5、測分子有Raf激酶抑制白，PAK6蛋白和DAB2IP基因等。但是目前為止尚未有一個公認的標志性分子能預測前列腺癌細胞的放射敏感性。
　　 二、研究目的:
　　 雖然很多研究表明GnT-V和多種腫瘤的惡性生物學行為密切相關，但是目前關于GnT-V與前列腺癌惡性生物學行為的相關研究較少，因此在本研究中，我們采用免疫組化檢測GnT-V在前列腺癌組織中的表達情況，以期探討GnT-V在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展及轉移中的作用。同時我們利用

6、shRNA，下調前列腺癌細胞PC3中GnT-V的表達量，得到了低表達GnT-V的細胞株PC3GnT-V/1564及PC3GnT-V/1079。通過體內及體外實驗對比正常的前列腺癌細胞和低表達GnT-V的前列腺癌細胞的放射敏感性，更重要的是，還研究了GnT-V對前列腺癌細胞放射敏感性的內在機制。
　　 三、實驗方法:
　　 1、前列腺癌組織芯片制作:由陜西超英生物科技有限公司完成。
　　 2、pGPU6/GFP/N

7、eoGnT-VshRNA質粒的構建及鑒定:由上海吉瑪公司完成。
　　 3、細胞培養(yǎng)及轉染
　　 人前列腺癌細胞株PC3在37℃5％CO2條件下，培養(yǎng)于含10％新生牛血清的RPMI-1640中，每周傳代2～3次。PC3細胞培養(yǎng)至對數生長期，參照invitrogen公司Lipofectamine2000TM產品說明書，用脂質體Lipofectamine2000TM將質粒導入PC3細胞。用G418篩選陽性細胞克隆。
　　

8、 4、干擾效果檢測
　　 (1)RT-PCR測定GnT-VmRNA
　　 用Trizol提取對數生長期的單層培養(yǎng)細胞總RNA，采用AMV逆轉錄合成cDNA.GnT-V上游引物為5'GAGCAGATCCTGGACCTCAG3'，下游引物為5'GCTGTCATGACTCCAGCGTA3'。使用β-actin作為內參，上游引物為5'GAAACTACCTTCAACTCCATC3'，下游引物為5'CGAGGCCAGGATGGAG

9、CCGCC3'。反應條件為:95℃預變性30s，PCR:94℃5s，60℃30s，共40個循環(huán)，溶解曲線:95℃0s，65℃60s，95℃0s.
　　 基于目的基因和看家基因實時熒光定量擴增曲線得到Ct(C為Cycle，t為threshold)值，△CT代表目的基因相對于內參基因的表達強度，公式為△CT=Ct目的基因-Ct內參基因。用Folds=2-△△Ct表示實驗組目的基因與對照組目的基因表達量的倍比關系，△△Ct=△CT實驗

10、組-△CT對照組。目的基因為GnT-V，內參基因為β-actin。
　　 (2)Westernblot檢測GnT-V蛋白表達
　　 提取總蛋白，用測定蛋白濃度，吸取50μg總蛋白，去離子水補至20μL，加入等體積2×上樣buffer煮沸7min，離心后吸取30μL上樣，經不連續(xù)SDS-PAGE電泳分離后，用半干法電轉移至PVDF膜上，5％脫脂奶粉37C封閉2h，TBST洗膜后用羊抗人GnT-V蛋白多克隆抗體(1:200)

11、、羊抗人β-actin蛋白單克隆抗體(1:1000)4℃孵育過夜，洗膜后分別加入HRP標記的兔抗羊IgG(1:500)、HRP標記的兔抗羊IgG(1:5000)，室溫下搖動1h，洗膜后用ECL化學發(fā)光系統(tǒng)檢測，暗室曝光X線片，沖洗膠片，UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像，Image-ProPlus6.0軟件分析條帶灰度值，用GnT-V/β-actin代表GnT-V的相對表達量。
　　 5、干擾后對前列腺癌細胞放射敏感性的影響
　　

12、(1)平板克隆形成實驗檢測pGPU6/GFP/NeoGnT-VshRNA干擾后對PC3細胞放射敏感性的影響
　　 取各組對數生長期的待測細胞，接種于6孔板，24h后分別給予0Gy,2Gy,4Gy,6Gy,8Gy五個計量點照射，之后置于37℃5％CO2條件下靜止培養(yǎng)3周，待出現肉眼可見克隆時，終止培養(yǎng)，加入0.1％結晶紫染色，肉眼計數。通過克隆數計算出細胞生存分數。實驗分為PC3組，PC3GnT-V/NC組，PC3GnT-V/10

13、79組和PC3GnT-V/1564組，每組重復例數為9。
　　 (2)CCK-8法測定pGPU6/GFP/NeoGnT-VshRNA干擾后對PC3細胞單次6Gy照射后增殖能力的影響。
　　 取各組對數生長期的待測細胞，消化，計數，制備單細胞懸液，將細胞懸液稀釋成終濃度為1×105個/ml接種子96孔板，每孔1×104個細胞，每組細胞6個復孔，鋪板后置于37℃5％CO2條件下靜止培養(yǎng)24h，給予6Gy照射。CCK-8法分析

14、不同時間點(0h、24h、48h、72h、96h)的細胞活力，每個時間點分別檢測6個復孔。測量兩組的OD450nm值，繪制生長曲線，并計算干擾組的生長抑制率。細胞生長抑制率(IR)=（對照組OD450值-干擾組OD450值）/對照組OD450值×100％。實驗分為PC3組，PC3GnT-V/NC組，PC3GnT-V/1079組和PC3GnT-V/1564組，每組重復例數為18。
　　 (3)Hoechst33258核染色及流式細

15、胞術檢測pGPU6/GFP/NeoGnT-VshRNA干擾對PC3細胞照射前后凋亡的影響。
　　 取對數生長期的細胞，給予0Gy及6Gy照射，72h后移去培養(yǎng)基，用1×pBS洗2次，4％多聚甲醛液室溫固定20min，移去固定液，用PBS清洗2次，然后室溫孵育終濃度1ug/ml的Hoeehst33258染色液5分鐘。孵育完畢后用PBS簡單清洗2次，吸盡液體，滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片。然后在熒光顯微鏡下

16、觀察細胞核形態(tài)。實驗分為PC3組，PC3GnT-V/NC組和PC3GnT-V/1079組，每組重復例數為9。
　　 取對數生長期的細胞，給予0Gy及6Gy照射，72h后消化細胞，1×PBS洗3遍，取1×105個細胞，加入195μLAnnexinvPE結合液重懸細胞，再加入5μLAnnexinvPE和1μL7-AAD輕輕混勻，室溫避光孵育10分鐘。1000rpm/min離心5分鐘，棄上清，加入200μLAnnexinvPE結合液重

17、懸細胞，流式細胞儀檢測。實驗分為PC3GnT-V/NC組和PC3GnT-V/1079組，每組重復例數為9。
　　 (4)比色分析法測定Caspase-3活性
　　 取對數生長期的細胞，給予6Gy照射，24、48、72h后，消化離心，預冷的裂解緩沖液冰上裂解細胞20min。4C20000×g離心3min，收集上清與Caspase-3底物DEVD-P-NA以及反應緩沖液混合，37℃孵育4h，用96孔板在酶標儀405nm比色。

18、PBS作為陰性對照組。重復3次。樣品OD(405nm)值與對照樣品OD(405nm)值的比值為Caspase-3活性的百分率。實驗分為PC3組，PC3GnT-V/NC組和PC3GnT-V/1079組，每組重復例數為9。
　　 (5)流式細胞術檢測pGPU6/GFP/NeoGnT-VshRNA干擾對PC3細胞照射前后周期的影響。
　　 取各組對數生長期的待測細胞，給予0Gy，2Gy，6Gy，10Gy照射，72h后消化細胞，

19、1×pBS洗3遍，取1×106個細胞，加入2ml于-20℃預冷的70％乙醇，4℃冰箱過夜。染色前用PBS離心沉淀去除固定液，冷PBS洗2次。加入100μLRNA酶RNaseA，37℃水后冰上終止RNaseA作用。每ml細胞懸液加入50μg/ml碘化丙啶PI染色液100μL混勻，4℃避光30min。流式細胞儀檢測。實驗分為PC3GnT-V/NC組和PC3GnT-V/1079組，每組重復例數為9。
　　 (6)Westernblot

20、檢測pGPU6/GFP/NeoGnT-VshRNA對PC3細胞照射前后凋亡相關蛋白的改變
　　 提取總蛋白，測定蛋白濃度，吸取50μg總蛋白，用PBS補至20μL，加入5μL5×SDS上樣buffer煮沸5min，離心后吸取25μL上樣，經不連續(xù)SDS-PAGE電泳分離后，用半干法電轉移至PVDF膜上，5％脫脂奶粉37℃封閉2h，TBST洗膜后用羊抗人bcl-2蛋白多克隆抗體(1:300)、羊抗人bcl-xl蛋白多克隆抗體(1:

21、200)、羊抗人bax蛋白單克隆抗體(1:200)、羊抗人β-actin蛋白單克隆抗體(1:1000)4℃孵育過夜，洗膜后分別加入HRP標記的兔抗羊IgG(1:500)、HRP標記的兔抗羊IgG(1:5000)，室溫下搖動1h，洗膜后用ECL化學發(fā)光系統(tǒng)檢測，暗室曝光X線片，沖洗膠片，UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像，Image-ProPlus6.0軟件分析條帶灰度值，用bax/β-actin代表bax的相對表達量。實驗分為PC3組，PC3GnT

22、-V/NC組和PC3GnT-V/1079組，每組重復例數為3。
　　 6、體內實驗
　　 (1)裸鼠成瘤實驗
　　 6周齡BALB/c裸鼠，雄性。每組各16只。細胞重懸于RPMI-1640，調整細胞濃度為2.5×107/ml，按200tL/只進行臀部皮下注射。當腫瘤體積達200-300mm3，隨機分為兩組即處理組和對照組，處理組給予2Gy照射連續(xù)5天，對照組不照射。照射后每隔3d測量腫瘤長徑和短徑，按V=0.5a

23、b2(V代表腫瘤體積，a為長徑，b為短徑)繪制生長曲線，并記錄裸鼠生存時間。
　　 (2)生存分析
　　 每組取10只裸鼠，建立裸鼠成瘤模型（具體方法同前），記錄每只裸鼠的生存天數。
　　 7、免疫組化
　　 組織芯片及石蠟切片脫蠟和水化后，對組織抗原進行相應的修復。切片加內源性過氧化物酶阻斷劑，室溫下孵育10分鐘，加動物非免疫血清（兔/鼠），室溫下孵育20分鐘。除去血清，每張切片加一滴一抗(GnT-V多

24、克隆抗體(1:200)、(Bax單克隆抗體(1:200)、Bci-2多克隆抗體(1:300)、Bcl-xl多克隆抗體(1:300))，室溫下孵育60分鐘。切片加生物素標記的兔抗羊IgG，室溫下孵育10分鐘。除去PBS液，每張切片加鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化酶，室溫下孵育10分鐘。沖洗后滴新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察。自來水沖洗，蘇木素復染。
　　 6、統(tǒng)計學分析
　　 實驗結果均經SPSS13.0軟件統(tǒng)計。所給數據為

25、均數±標準差。以P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。實時定量RT-PCR、Western-Blot實驗結果多組比較采用one-wayANOVA分析。平板克隆實驗、CCK8細胞增殖實驗、細胞凋亡實驗、細胞周期實驗多組比較采用析因設計的方差分析;組內多重比較若方差不齊采用DunnettT3法、若方差齊采用LSD法;兩組間的比較采用兩獨立樣本t檢驗。Caspase-3活性檢測實驗兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。皮下成瘤試驗瘤體體積采用重復測量的方差

26、分析;組內比較采用one-wayANOVA分析;組內的多重比較若方差不齊采用DunnettT3法、若方差齊采用LSD法。三組生存時間的比較采用Kaplan-Merer法分析。參數比較均先進行方差齊性檢驗，若方差不齊，用基于方差不齊的近似F檢驗Welch法。
　　 四、結果:
　　 1、重組質粒的穩(wěn)定轉染
　　 質粒pGPU6/GFP/Neo中含有編碼GFP的基因，故轉染細胞在熒光顯微鏡下可激發(fā)出綠色熒光。在熒光顯

27、微鏡下觀察，所有轉染細胞均發(fā)熒光，說明穩(wěn)定轉染成功。
　　 2、干擾效果檢測
　　 實時定量PCR實驗結果得出PC3GnT-V/1564和PC3GnT-V/1079組細胞GnT-V基因的表達較PC3GnT-V/NC組明顯降低，表明轉染GnT-VshRNA載體能抑制目的基因mRNA表達，Westernblot結果也顯示轉染GnT-VshRNA載體能抑制GnT-V蛋白表達。Image-ProPlus6.0軟件分析GnT-V基

28、因mRNA及蛋白的表達水平，按照公式進行計算后顯示PC3GnT-V/1079、PC3GnT-V/1564組mRNA水平的抑制率分別為78.3％和66.8％，蛋白水平的抑制率分別為73.7％和57.9％，與PC3GnT-V/NC組相比均有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。
　　 3、GnT-VshRNA對細胞放射敏感性的影響
　　 (1)、以細胞在不同照射劑量(0Gy,2Gy,4Gy,6Gy,8Gy)的克隆形成率繪制細胞生成率

29、曲線，PC3GnT-V/1564及PC3GnT-V/1079組的生存率較PC3組及PC3GnT-V/NC組低，差異有統(tǒng)計學意義;而PC3GnT-V/1564及PC3GnT-V/1079組之間差異無統(tǒng)計學意義。說明下調GnT-V的表達后細胞的放射敏感性增高。
　　 (2)、以細胞在6Gy放療后不同時間點(0h、24h、48h、72h、96h)繪制細胞生長曲線，PC3GnT-V/1564及PC3GnT-V/1079的生長抑制率較PC

30、3組及PC3GnT-V/NC組高，差異有統(tǒng)計學意義;而PC3GnT-V/1564及PC3GnT-V/1079組之間差異無統(tǒng)計學意義?？梢娤抡{GnT-V的表達后細胞的放射敏感性增高。因PC3GnT-V/1564與PC3GnT-V/1079組細胞GnT-V蛋白表達量相差約10％，其差異不足以影響其放射敏感性（根據平板克隆實驗及CCK-8實驗結果）。選擇干擾效率較高的PC3GnT-V/1079進行下一步實驗（在做了平板克隆實驗及CCK-8實驗

31、之后）。
　　 4、GnT-VshRNA對細胞放療前后凋亡的影響
　　 Hoechst33258及流式細胞AnnexinV-PE/7-AAD法測定放射前后細胞的凋亡。放射治療前PC3GnT-V/NC組、PC3GnT-V/1079組細胞的凋亡率分別為:(1.52±0.43)％、(8.81±0.65)％;放射治療后PC3GnT-V/NC組、PC3GnT-V/1079組細胞的凋亡率分別為:(9.21±0.23)％、(21.39

32、±1.72)％。下調GnT-V可提高PC3細胞放療后的凋亡率。
　　 5、GnT-VshRNA對細胞放療后caspase-3活性的影響
　　 PC3GnT-V/1079組caspase-3活性在放療后24h、48h及72h均高于PC3、PC3GnT-V/NC組。
　　 6、GnT-VshRNA對細胞放療前后周期的影響
　　 PC3GnT-V/NC組細胞照射后可見明顯G2/M阻止;PC3GnT-V/1079

33、組細胞照射后無明顯G2/M期阻止。
　　 7、GnT-VshRNA對裸鼠皮下成瘤實驗的影響
　　 X線照射后，PC3GnT-V/1079體積增長較PC3和PC3GnT-V/NC速度慢，差異顯著。PC3GnT-V/1079生存期較PC3和PC3GnT-V/NC長。
　　 免疫組化實驗示:Bcl-2表達于胞漿及細胞核中，PC3GnT-V/1079表達量低于PC3GnT-V/NC;Bax表達于胞漿，PC3GnT-V/1

34、079表達量高于PC3GnT-V/NC;Bcl-xl表達于胞漿，PC3GnT-V/1079及PC3GnT-V/NC表達量無明顯差異。
　　 8、GnT-VshRNA對細胞放射前后凋亡相關蛋白表達的影響
　　 實驗結果表明，PC3GnT-V/1079組細胞在放射治療后Bax表達量高于PC3及PC3GnT-V/NC組;Bcl-2表達量低于PC3及PC3GnT-V/NC組。
　　 9、免疫組化檢測GnT-V在前列腺癌組

35、織中的表達
　　 實驗結果發(fā)現:GnT-V在5例前列腺增生組織中不表達，在85例前列腺癌組織中其中83例有表達。且GnT-V在前列腺癌組織中的表達隨前列腺癌病理分化程度降低而升高，隨著臨床分期及Gleason評分增高而升高。
　　 五、結論:
　　 1、GnT-V在前列腺增生組織中不表達，在前列腺癌組織中的表達隨前列腺癌病理分級、臨床分期及Gleason評分增高而升高。
　　 2、靶向GnT-V的shRN