垂體特異轉錄因子-1在生長激素腺瘤生物學行為中作用的實驗研究.pdf

1、第一部分 pit-1、c-myc基因在垂體生長激素腺瘤中表達的生物學意義 目的： 1、觀察垂體特異轉錄因子Pit-1、C-myc基因在垂體生長激素腺瘤中的表達。 2、研究pit-1基因、c-myc基因與垂體生長激素腺瘤GH水平的關系，并分析其相關性。 3、探討pit-1基因、c-myc基因在垂體生長激素腺瘤發(fā)病機制中可能的作用。 方法： 用免疫組織化學鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶

2、復合物法(SABC)和圖像分析技術測定Pit-1蛋白、C-myc蛋白在垂體生長激素腺瘤中的表達。 結果： 1、Pit-1蛋白在全部的GH腺瘤中均有高表達，與對照組相比，有顯著性差異(P＜0.01)。GH瘤組中pit-1的表達量與其術前的激素水平呈顯著正相關(r=0.966)。 2、C-myc蛋白在26例GH腺瘤中有19例表達，表達率為73.1％，正常垂體組織中未見表達，二者比較有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。C

3、-myc的表達與激素水平呈相關性。 結論： 1.pit-1基因在所有生長激素腺瘤中均高表達，其表達與GH水平、腫瘤的侵襲性呈正相關，在GH腺瘤發(fā)病機制中起重要作用。 2.c-myc基因在絕大多數(shù)GH腺瘤中有表達，其表達與GH水平、腫瘤的侵襲性呈正相關，在垂體生長激素腺瘤細胞增殖、腫瘤的侵襲性方面發(fā)揮重要作用。 第二部分 抑制pit-1對GH腺瘤細胞生物學行為的影響 目的： 1、觀察

4、pit-1-AODN對生長激素腺瘤細胞增殖、激素水平的影響； 2、觀察pit-1-AODN對GH腺瘤細胞凋亡及細胞周期的影響。 3、觀察pit-1-AODN對GH腺瘤細胞中Pit-1、pit-1-mRNA和C-myc、c-mycmRNA的表達調控。 4、探討pit-1基因與c-myc基因的相關關系及pit-1-AODN抑制GH腺瘤細胞增殖、激素水平及誘導瘤細胞凋亡和改變細胞周期的作用機制。 方法：

5、 1、以脂質體為載體包裹pit-1-AODN，制成能進入細胞內的pit-1“反義基因封條”；以pit-1正義寡核苷酸(SODN)為對照。 2、用MTT法測定pit-1-AODN對GH腺瘤細胞增殖的影響。 3、RIA法測定Pit-1ODN對GH腺瘤細胞分泌生長激素的影響。 4、用流式細胞儀(FCM)檢測細胞凋亡和細胞周期的改變。 5、免疫細胞化學方法測定pit-1-AODN對GH腺瘤細胞中pit-1、c-m

6、yc蛋白表達的變化。 6、用RT-PCR法檢測干預前后pit-1mRNA、c-mycmRNA表達的變化。 結果： 1、pit-1-AODN在一定的時間、濃度范圍內，呈劑量、時間依賴性方式抑制腫瘤細胞生長，正義組、對照組無此作用。 2、pit-1-AODN對腫瘤細胞分泌GH激素水平的抑制作用表現(xiàn)出時間和劑量依賴性。20μmol/L組在24、48、72h時對GH水平的抑制率分別是9.23％、23.1％、46.

7、0％，各組間相比較，有顯著性差異(各P＜0.05)，96h組與72h組間比較，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，120h組與各組比較，各P＜0.01。 3、不同濃度的AODN作用于GH腺瘤細胞48h后，均顯示出亞G1峰(為凋亡峰)，AODN呈劑量依賴性非線性方式誘導其凋亡，且呈濃度依賴性改變細胞周期的分布，在一定濃度范圍內，隨濃度的增加，G2/M細胞比例增加。 4、在12例組織標本中，全部有pit-1、pit-1mRNA的表

8、達，經(jīng)pit-1AODN(20μM、40μM組)處理后，10例pit的表達均明顯下降；9例有C-myc、c-mycmRNA的表達，經(jīng)pit-1AODN處理后，7例C-myc、c-mycmRNA的表達均明顯下降，2例表達下降不明顯。統(tǒng)計學分析表明，Pit-1、pit-1mRNA和C-myc、c-mycmRNA在干預前后的表達有顯著性差異(P＜0.05)。 結論： 1、Pit-1AODN對GH腺瘤細胞的增殖、GH水平有較強的

9、抑制作用。 2、Pit-1AODN夠明顯抑制GH腺瘤細胞pit-1、pit-1mRNA和C-myc、c-mycmRNA的表達。 第三部分 pit-1反義寡核苷酸對奧曲肽治療GH腺瘤作用影響的實驗研究 目的： 1、觀察pit-1反義寡核苷酸對奧曲肽抑制GH腺瘤細胞作用的影響。 2、與奧曲肽對照研究，評價Pit-1AODN治療垂體GH腺瘤的應用效果和前景，為以pit-1為靶點治療垂體GH腺瘤的

10、應用提供理論和實驗依據(jù)。 方法： 1、MTT法測定pit-1AODN對Octreotide抑制GH瘤細胞增殖抑制的影響。 2、RIA法測定pit-1AODN對Octreotide抑制細胞培養(yǎng)液GH水平的影響。 3、FCM測定pit-1AODN對Octreotide誘導細胞凋亡及細胞周期改變的影響。 4、Westernblot法測定pit-1AODN和Octreotide對GH腺瘤細胞中pit-1、

11、c-myc蛋白表達的影響。 5、Boyden小室體外侵襲試驗，比較pit-1AODN和Octreotide對GH腺瘤細胞侵襲力的影響。 結果： 1、在96、120h時，pit-1AODN與Octreotide兩組間比較，對GH腺瘤細胞增長抑制有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，余時間點兩組間無差異。二者聯(lián)合應用時，Octreotide對pit-1AODN的作用有協(xié)同作用。 2、48h時，pit-1AODN組與O

12、ctreotide組相比，GH水平顯著下降，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，余時間點二者間無差異。D組GH水平明顯受抑制，與B、C及對照組相比，有高度顯著性差異(P＜0.01)； 3、AODN組在一定范圍內，隨時間的增加，G2/M細胞比例增加。在Octreotide組，G0/G1期細胞比例增加，S期細胞比例減少，有時間依賴性。D組誘導細胞凋亡的作用明顯優(yōu)于B、C組，具有顯著的統(tǒng)計學差異(P均＜0.05)。 4、pit-1A

13、ODN較Octreotide對pit-1、c-myc蛋白的表達有明顯的抑制作用。 5、pit-1AODN較Octreotide能降低GH腺瘤細胞的侵襲能力。 結論： 1、pit-1AODN與Octreotide均能顯著抑制GH腺瘤的增殖、GH水平，但pit-1AODN出現(xiàn)抑制時間早，效果好。 2、pit-1AODN與Octreotide通過不同的途徑均能促進細胞凋亡、改變細胞周期，二者均有較好的協(xié)同作用。