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文檔簡介
1、目的:體外研究hIGF-1基因轉染人臍帶血間充質干細胞的實驗學方法，檢測并觀察基因轉染后臍帶血間充質干細胞(hUCB-MSCs)的生物學變化。
方法:利用密度梯度離心法與細胞貼壁法相結合分離培養(yǎng)hUCB-MSCs，流式細胞儀檢測細胞表面抗原標記。構建真核表達質粒并以X-tremen HP介導將含hIGF-1基因的質粒pIRES2-EGFP-hIGF-Ⅰ轉染hUC-MSCs，倒置熒光顯微鏡觀察轉染后細胞內綠色熒光蛋白的表達，
2、酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測轉染后不同時間段細胞上清液中hIGF-1的濃度，免疫熒光與RT-PCR檢測hIGF-1在細胞中的表達，免疫組化染色檢測Ⅱ型膠原表達。
結果:密度梯度離心法與細胞貼壁法相結合可獲得純度較高的hUCB-MSCs，流式細胞儀細胞表面抗原標志CD90、CD105、CD146表達陽性，CD34、CD45、Anti-HLA-DR表達陰性。經X-tremen HP介導hIGF-1目的基因可導入UCB-MSCs其轉染效
3、率為(28.63±7.59)％，免疫熒光和RT-PCR鑒定均檢測到hIGF-1的表達。轉染后細胞形態(tài)由長梭形逐漸變?yōu)閳A形或橢圓形，以后逐漸變?yōu)槎嘟切?。ELISA檢測hIGF-Ⅰ蛋白質分泌在48h達到高峰(34.68±1.4ng/ml)，與對照組相比，具有顯著性差異(p＜0.01)。細胞免疫組化結果顯示經轉染后的細胞Ⅱ型膠原表達陽性。
結論:成功構建真核表達載體pIRES2-EGFP-hIGF-Ⅰ，密度梯度離心法與細胞貼壁法
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