AQP1對(duì)SCs形態(tài)、水轉(zhuǎn)運(yùn)的影響以及缺氧誘導(dǎo)AQP1表達(dá)的機(jī)制研究.pdf

1、[研究背景]
　　 面神經(jīng)解剖特殊，損傷后受骨性面神經(jīng)管壓迫，常形成“水腫—缺血—水腫”的惡性循環(huán)，如何預(yù)防或減輕面神經(jīng)的水腫在面癱臨床治療中具有極其重要的意義。
　　 水通道蛋白(AQPs)是存在于細(xì)胞膜上，介導(dǎo)不同類(lèi)型細(xì)胞跨膜水轉(zhuǎn)運(yùn)的膜蛋白家族，與多種組織器官水腫形成和消除密切相關(guān)，在水液代謝的調(diào)節(jié)中起重要作用。其中AQP1是周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)表達(dá)最多的水通道蛋白。我們前期工作證實(shí)了面神經(jīng)組織內(nèi)存在AQP1的表達(dá)，并在小鼠

2、面神經(jīng)離斷傷模型中發(fā)現(xiàn)面神經(jīng)損傷后AQP1表達(dá)增高，與面神經(jīng)損傷后水腫時(shí)相性變化高度一致，提示AQP1與面神經(jīng)損傷后繼發(fā)性水腫密切相關(guān)，并進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)AQP1定位在雪旺細(xì)胞上。但是AQP1表達(dá)增高與面神經(jīng)水腫的因果關(guān)系還未確定，即AQP1的高表達(dá)導(dǎo)致或加劇面神經(jīng)水腫？還是面神經(jīng)水腫伴隨AQP1的高表達(dá)尚無(wú)定論;且AQP1在雪旺細(xì)胞內(nèi)如何發(fā)揮生理和病理作用也不清楚。
　　 因此，本課題應(yīng)用RNA干擾和過(guò)表達(dá)技術(shù)分別下調(diào)和上調(diào)雪旺

3、細(xì)胞AQP1表達(dá)，研究AQP1表達(dá)變化在生理狀態(tài)下對(duì)雪旺細(xì)胞形態(tài)和水轉(zhuǎn)運(yùn)的影響;并制作雪旺細(xì)胞CoCl2缺氧模型，模擬體內(nèi)面神經(jīng)損傷，研究在缺氧病理狀態(tài)下AQP1的表達(dá)變化及其對(duì)雪旺細(xì)胞形態(tài)和水轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，以確定AQP1表達(dá)與雪旺細(xì)胞腫脹的因果關(guān)系，并探討雪旺細(xì)胞缺氧損傷后誘導(dǎo)AQP1表達(dá)增加的可能分子機(jī)制，為臨床預(yù)防或減輕面神經(jīng)水腫后的繼發(fā)損傷提供理論依據(jù)。
　　 [目的]
　　 1、探討AQP1基因表達(dá)和雪旺細(xì)胞腫脹

4、之間的因果關(guān)系;
　　 2、明確AQP1在面神經(jīng)損傷后水腫中的基因功能，為臨床預(yù)防或治療面神經(jīng)水腫提供新思路;
　　 3、研究雪旺細(xì)胞在缺氧病理狀態(tài)下缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）對(duì)AQP1表達(dá)的影響，探討雪旺細(xì)胞缺氧損傷后誘導(dǎo)AQP1表達(dá)增加的分子機(jī)制。
　　 [方法]
　　 1、應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)驗(yàn)證小鼠面神經(jīng)來(lái)源的原代雪旺細(xì)胞AQP1表達(dá)
　　 (1)采用酶消化法原代培養(yǎng)C57BL/6小鼠面

5、神經(jīng)雪旺細(xì)胞，差速貼壁法提純;
　　 (2)免疫熒光共標(biāo)染色鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞AQP1和S-100表達(dá)。
　　 2、慢病毒介導(dǎo)的AQP1-shRNA對(duì)小鼠雪旺細(xì)胞形態(tài)及水轉(zhuǎn)運(yùn)的影響
　　 (1)小鼠AQP1-shRNA慢病毒載體構(gòu)建與鑒定:對(duì)小鼠AQP1 mRNA分析，設(shè)計(jì)合成的單鏈引物經(jīng)退火形成雙鏈oligo序列，連接入經(jīng)AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切線(xiàn)性化的pLKO.1-TRC慢病毒質(zhì)粒載體中，菌液PCR鑒定并經(jīng)測(cè)序

6、驗(yàn)證。測(cè)序正確后與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集病毒上清經(jīng)高速離心濃縮后感染小鼠雪旺細(xì)胞，RT-PCR和Western blot法分析篩選有效shRNA序列;
　　 (2) AQP1-shRNA感染雪旺細(xì)胞后，與CTRL組（scr-shRNA）比較，每天在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，連續(xù)6天;
　　 (3)細(xì)胞容積測(cè)定量化AQP1-shRNA細(xì)胞與CTRL(scr-shRNA)細(xì)胞水含量變化;
　

7、　 (4) MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖;
　　 (5)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AQP1-shRNA對(duì)雪旺細(xì)胞凋亡的影響。
　　 3、慢病毒介導(dǎo)的AQP1過(guò)表達(dá)對(duì)小鼠雪旺細(xì)胞形態(tài)及水轉(zhuǎn)運(yùn)的影響
　　 (1)小鼠AQP1基因慢病毒載體構(gòu)建與鑒定:將小鼠AQP1基因克隆到慢病毒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP載體，通過(guò)PCR和測(cè)序鑒定獲得連接正確的克隆。將鑒定后的重組表達(dá)質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGF

8、P-AQP1與包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，制備攜帶AQP1基因的慢病毒Lemi-AQP1，感染雪旺細(xì)胞，RT-PCR和Westem blot檢測(cè)感染后雪旺細(xì)胞AQP1mRNA和蛋白表達(dá)情況;
　　 (2) Lenti-AQP1感染雪旺細(xì)胞后，與CTRL組(empty vector)比較，每天在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，連續(xù)6天;
　　 (3)細(xì)胞容積測(cè)定量化Lenti-AQP1細(xì)胞與CTRL細(xì)

9、胞水含量變化。
　　 4、缺氧狀態(tài)下AQP1對(duì)小鼠雪旺細(xì)胞形態(tài)及水轉(zhuǎn)運(yùn)的影響
　　 (1)制作雪旺細(xì)胞CoCl2缺氧模型，模擬體內(nèi)面神經(jīng)損傷，RT-PCR、Western blot、免疫熒光染色鑒定AQP1表達(dá)變化;
　　 (2) AQP1-shRNA處理后雪旺細(xì)胞，在缺氧狀態(tài)下與CTRL組比較，觀察缺氧后細(xì)胞形態(tài)變化情況，細(xì)胞容積測(cè)定鑒定細(xì)胞水含量變化。
　　 5、缺氧誘導(dǎo)AQP1表達(dá)增加的機(jī)制研究

10、r>　　 (1)雪旺細(xì)胞缺氧后RT-PCR、Western blot鑒定HIF-1α表達(dá);
　　 (2)應(yīng)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染抑制HIF-1α表達(dá)，研究HIF-1αsiRNA對(duì)AQP1蛋白表達(dá)的影響。
　　 [結(jié)果]
　　 1、小鼠原代面神經(jīng)雪旺細(xì)胞表達(dá)AQP1;
　　 2、成功退火合成3對(duì)發(fā)夾shRNA序列并將其克隆到pLKO.1-TRC載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pLKO-AQP1-SH1、2、3，經(jīng)菌液PCR鑒定和

11、測(cè)序驗(yàn)證載體構(gòu)建成功。Realtime-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒pLKO-AQP1-SH2感染雪旺細(xì)胞后AQP1 mRNA表達(dá)最低，Western blot結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性;AQP1 shRNA能使雪旺細(xì)胞形態(tài)皺縮，細(xì)胞水含量明顯降低(P＜0.001);AQP1-shRNA細(xì)胞較CTRL組細(xì)胞增殖活力降低(P＜0.05)，但不會(huì)引起雪旺細(xì)胞明顯的凋亡。
　　 3、構(gòu)建的慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copG

12、FP-AQP1經(jīng)PCR鑒定和測(cè)序正確，慢病毒Lenti-AQP1感染雪旺細(xì)胞后AQP1mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加;AQP1過(guò)表達(dá)使雪旺細(xì)胞腫脹，細(xì)胞形態(tài)近似圓形，細(xì)胞水含量顯著增加(P＜0.001);
　　 4、雪旺細(xì)胞缺氧后AQP1mRNA和蛋白表達(dá)水平增加，免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)AQP1強(qiáng)烈表達(dá)在雪旺細(xì)胞膜上，細(xì)胞形態(tài)近似橢圓形;慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AQP1-sh細(xì)胞較scr-sh細(xì)胞缺氧后細(xì)胞腫脹不明顯(P＜0.001);
　　

13、 5、雪旺細(xì)胞缺氧后HIF-1αmRNA和蛋白表達(dá)水平增加，HIF-1αsiRNA降低了體外缺氧誘導(dǎo)AQP1蛋白表達(dá)水平。
　　 [結(jié)論]
　　 1、AQP1是控制雪旺細(xì)胞快速水轉(zhuǎn)運(yùn)的主要因素;
　　 2、AQP1是參與雪旺細(xì)胞可塑性的一種蛋白;
　　 3、AQP1表達(dá)變化是缺血、缺氧誘導(dǎo)面神經(jīng)水腫的主要因素;
　　 4、HIF-1α參與缺氧誘導(dǎo)AQP1表達(dá)增高;
　　 5、抑制AQP1