活化ARE通路對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元保護(hù)作用的研究.pdf

1、肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis ALS)是一個(gè)致命的神經(jīng)變性疾病。它的主要病理改變是選擇性地?fù)p傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(包括大腦皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)核和脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元)。臨床表現(xiàn)為緩慢進(jìn)展的四肢無(wú)力，累及呼吸肌，多于發(fā)病3-5年內(nèi)死亡。ALS 可分為家族型肌萎縮側(cè)索硬化(Familial Amyotrophic Lateral Sclerosis，F(xiàn)ALS)和散發(fā)型肌萎縮側(cè)索硬化(Sporad

2、ic Amyotrophic Lateral Sclerosis，SALS)，90％以上為散發(fā)型不足lO％為家族型。 其中FALS主要是由于編碼Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)的基因突變引起，其突變位點(diǎn)在21號(hào)染色體長(zhǎng)臂Cu/Zn SOD 基因內(nèi)，即21q22.1-22.2。與ALS有關(guān)的SOD1基因的突變大約有100余種。在這些突變中SOD酶的活性基本正?；蛏撸琒OD基因敲除的小鼠則沒(méi)有發(fā)病。這些發(fā)現(xiàn)提示SOD1相關(guān)的A

3、LS不是因?yàn)楣δ苋笔Ф?，而是可能由一種獲得性毒性引起。 在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性過(guò)程中牽涉到幾個(gè)機(jī)制：興奮毒性、免疫反應(yīng)、線粒體功能障礙及自由基損傷、蛋白質(zhì)異常聚積、蛋白酶體功能改變和凋亡。雖然這些通路對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷的啟動(dòng)和進(jìn)展都起作用，但是這些通路之間的相互反應(yīng)以及哪個(gè)起主要作用還不明了。 這些機(jī)制不是互相排斥的而是可以被一個(gè)共同的反應(yīng)所激活，這一共同的反應(yīng)的協(xié)調(diào)者正是氧化應(yīng)激。盡管確切機(jī)制尚不明了，但在導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損

4、傷的過(guò)程中，增加的氧化應(yīng)激是出現(xiàn)較早且持久的事件。氧化應(yīng)激不僅在ALS的發(fā)病中起了突出的作用，并且它通過(guò)活化其它各個(gè)通路，引起更新一輪的氧化應(yīng)激，促進(jìn)了疾病的進(jìn)展。所以許多研究的焦點(diǎn)集中在氧化應(yīng)激和自由基損傷。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(glutathione GSH)是細(xì)胞內(nèi)含量最豐富、最有效的反應(yīng)氧族(reactive oxygen species ROS)的直接清除劑。通過(guò)GSH 與氧化型谷胱甘肽(GSSG)的轉(zhuǎn)換來(lái)調(diào)

5、節(jié)ROS水平，GSH 減少則ROS產(chǎn)生增加并促進(jìn)氧化損傷。 另外GSH也是許多抗氧化酶的關(guān)鍵底物，這些酶解毒過(guò)氧化氫和脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物。正如CHI.L和KE.Y 等應(yīng)用離體和在體的實(shí)驗(yàn)證實(shí)那樣，GSH的缺失加強(qiáng)了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變性。 GSH的合成是一個(gè)ATP依賴的兩步酶促反應(yīng)。第一步由γ-谷氨酸半胱氨酸連接酶(γ-Glutamate Cysteine ligase GCL)催化完成，第二步由GSH 合成酶(GSH synt

6、hetase)催化完成。前者是重要的限速酶。分別有GCLC和GCLM兩個(gè)亞單位組成。隨著年齡的老化，在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織GCLM基因表達(dá)的下調(diào)，伴隨著GCL酶活力的減低和GSH 水平的降低。說(shuō)明在與年齡相關(guān)的神經(jīng)變性疾病中GCL及GSH發(fā)揮重要作用。 由谷胱甘肽S一轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase GST)家族是一個(gè)分布廣泛，包括近百種同工酶在內(nèi)的多基因大家族。GSTs屬Ⅱ相酶防御系統(tǒng)。具有多種生物學(xué)

7、功能如催化包括親電子試劑(electrophiles)、致癌物(carcinogens)和有基因毒性、細(xì)胞毒性的異生化合物(xenobiotics)與還原型谷胱甘肽(GSH)連接，使其轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水的易排泄物質(zhì)。GST 在神經(jīng)細(xì)胞氧化防御方面起重要作用。所以誘導(dǎo)內(nèi)源性Ⅱ相酶，如GST 已經(jīng)被提議作為治療PD的方法和癌癥的化學(xué)預(yù)防。 本課題根據(jù)谷氨酸的慢性興奮毒性機(jī)制，應(yīng)用谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑蘇一羥天冬氨酸(THA)，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)

8、細(xì)胞外谷氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，最終導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡。制備成慢性選擇性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷的脊髓器官型培養(yǎng)模型。 總之，慢性選擇性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷的脊髓器官型培養(yǎng)模型為神經(jīng)保護(hù)劑在人類運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的臨床試驗(yàn)和臨床前試驗(yàn)間提供了密切的聯(lián)系。該模型已經(jīng)成功地預(yù)言了力如唑(riluzole)和加巴噴丁(neurontin)有效的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元保護(hù)作用，這兩種藥已經(jīng)用于人類運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病。故本課題利用該模型，以誘導(dǎo)內(nèi)源性抗氧化劑為切入點(diǎn)尋求理想的治療靶點(diǎn)。

9、 在許多神經(jīng)變性疾病的病因涉及到神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)ROS 的堆積，細(xì)胞中和這些反應(yīng)中間產(chǎn)物的能力很大程度上依賴一個(gè)順式作用元件的活化，這個(gè)順式作用元件被命名為抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response elementARE)。它存在于抗氧化蛋白和解毒酶基因的5’端區(qū)域。在人類、大鼠、小鼠的多種組織中及原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元中都已證實(shí)，ARE驅(qū)動(dòng)的靶基因包括GCLC、GLCM 和GSTs等。 所以，本課題應(yīng)用A

10、RE活化劑，觀察其在該模型中對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的作用，并進(jìn)一步探討作用機(jī)制。 論文共分四部分： 第一部分證實(shí)ARE活化劑對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元確實(shí)存在保護(hù)作用。 第二部分探討這種保護(hù)作用伴隨著該模型中GSH水平和Ca<'2+>水平的變化，而與P75<'NTR>水平無(wú)關(guān)。 第三部分進(jìn)一步證實(shí)GSH合成的限速酶GCL 在該模型中存在異常，隨著ARE的保護(hù)作用，GCL的基因水平發(fā)生改變，說(shuō)明GSH水平的改變是其上游合成酶變化引