乙型肝炎病毒聚合酶新功能區(qū)的發(fā)現和意義研究.pdf

1、乙型肝炎病毒 (Hepatitis B virus，HBV) 感染在全球超過3億人。HBV屬于嗜肝DNA病毒科，該科具有部分雙鏈環(huán)狀的DNA基因組。HBV通過特有的逆轉錄反應進行復制。HBV編碼的聚合酶/逆轉錄酶 (Reverse transcriptase，RT)的結構和功能在其復制過程中起重要作用。但是，至今具有酶活性的HBV RT仍不能足量表達用于體外生化研究和晶體學分析。此外，也沒有合適的體外感染系統(tǒng)用于分析復雜的HBV復制周期

2、。通過對分離自乙肝病人的兩株B基因型HBV的全基因組克隆和基于細胞轉染的復制效率測定，我們曾報道HBV RT第306位脯氨酸(rtP306)置換為絲氨酸或其他氨基酸時，大部分變異體的復制效率下降。為闡明這些變異體復制效率下降的機理，我們首先構建－C基因型毒株的rtP306變異體并轉染Huh-7細胞，然后比較變異體與原毒株的復制能力、轉錄水平和pgRNA包裝效率。通過基于細胞轉染的復制效率測定發(fā)現rtP306變異體復制效率下降，而且RT變

3、異體與RT缺失復制子rtW58<'*>的反式補充實驗也證實這一現象。 為深入了解復制效率下降的機理，首先分析變異體和原毒株的轉錄水平，結果顯示各rtP306變異體具有相似的轉錄水平。而且Western印跡顯示rtP306氨基酸置換并不影響RT穩(wěn)定性。我們通過特異性的pgRNA包裝實驗和內源性聚合酶反應分析HBV RT的兩大主要功能：參與pgRNA包裝和催化核苷轉移合成子代病毒DNA。pgRNA包裝效率用細胞內衣殼顆粒量校正后的衣

4、殼顆粒內pgRNA量表示，細胞內衣殼顆粒用抗衣殼蛋白抗體進行Western印跡測定。包裝實驗結果顯示大部分rtP306變異體的pgRNA包裝效率下降。這一結果也被內源性聚合酶反應所確認。同時，通過內源性聚合酶反應發(fā)現一些rtP306氨基酸置換導致RT核苷轉移酶活性下降。 基于上述發(fā)現，我們推測除了rtP306外，rtP306附近的氨基酸(rt304-311)對HBV復制同樣重要。通過將rt304-311位氨基酸置換為丙氨酸或苯丙

5、氨酸構建變異體并測定其復制效率，我們發(fā)現rt304-311置換確實導致HBV復制效率明顯下降。相關機理不是轉錄水平或RT穩(wěn)定性改變而是pgRNA包裝效率下降。作為對照，遠離rtP306的氨基酸(rt336和rt346)置換不影響病毒復制效率。據我們所知，這是首次報道rt304-311氨基酸保守在pgRNA包裝中起重要作用。此外，與原毒株相比，rtY305A變異體對抗病毒藥阿德福韋的敏感性下降。阿德福韋據報道作用于HBV RT“手掌”域的

6、酶活性中心，而rtY305置換位于HBV RT“拇指”域，因此藥敏實驗提示rt304-311氨基酸置換可能改變HBV RT構型從而導致與抗病毒藥的親和力下降。 此外，通過生物信息學方法分析rt304-311對HBV RT和HBV復制的作用，結果顯示：1) 預測rt304-311位于HBV RT“拇指”域一螺旋-轉角-螺旋結構的轉角上，這一螺旋-轉角-螺旋結構稱為螺旋鉗基序；2)轉角氨基酸在已報導的基因型A-H毒株中非常保守；3)

7、部分HBV RT轉角氨基酸在逆轉錄病毒RT和丙型肝炎病毒RNA依賴的RNA聚合酶的螺旋鉗基序中保守。螺旋鉗基序是真核生物、細菌和病毒的核酸聚合酶拇指域中一共同的結構元件，在聚合反應時可結合核酸模板和引物。因此，我們通過生物學和結構生物信息學方法確認了HBV RT螺旋鉗基序轉角(rt304-311)，該轉角作為一新功能區(qū)可能通過控制HBV RT與核酸的親和力來調節(jié)HBV pgRNA包裝效率。 人免疫缺陷病毒 (Human immu

8、nodeficiency virus，HIV) 是逆轉錄病毒科慢病毒屬的研究模型。與HBV相似，HIV也通過特有的逆轉錄反應進行復制。為研究HIV RT螺旋鉗基序轉角是否在HIV復制中起重要作用，以一HIV前病毒質?；A上將HIV RT轉角置換為丙氨酸。通過單周期感染實驗檢測各變異體的復制能力。初步結果顯示HIV-1轉角變異體(rtY271A和rt1274A)不能在 Jurkat 細胞內復制。而且，HIV-1 RT轉角變異體(rtY27

9、1A和rt1274A)與DNA模板/引物結合能力下降?？傊?，HBV RT和HIV RT螺旋鉗基序轉角在病毒復制過程中起重要作用并且可以作為抗病毒藥物設計的新靶點。 目前，已注冊的抗HBV藥物如拉米呋啶，阿德福韋酯和恩替卡韋都是作用在HBV RT催化中心的核苷(酸)類似物。長期使用這些藥物將導致耐藥株的出現。因此迫切需要發(fā)展新的抗HBV藥物。在篩選針對HBV RT和HIV RT螺旋鉗基序轉角的化合物時，我們發(fā)現一種非核苷類似物KM

10、-1,2-萘磺酸，4-羥基-7-[[[[5-羥基—6-[(4-肉桂酸苯基)偶氮]-7-磺酸-2-萘基]氨基]羰基]氨基]-3-[(4-肉桂酸苯基)]偶氮(2-naphthalenesulfonic acid，(4-hydroxy-7-[[[[5-hydroxy-6-[(4-cinnamylphenyl)azo]-7-sulfo-2-naphthaIenyl]amino]carbonyl]amino]-3-[(4-cinnamylphen

11、yl)]azo))曾被報道通過與已知非核苷類似物不同的機制有效地抑制HIV RT。而且，據推測，KM-1針對HIV RT的“拇指”域。因此，我們采用多種方法評價KM-1的抗HBV活性。通過內源性聚合酶反應發(fā)現KM-1抑制野生型HBV RT及其對三磷酸拉米呋啶耐藥的變異體rtL180M/M2041，50％抑制濃度分別為2.6μM和0.5μM，因此KM-1通過與三磷酸拉米呋啶不同的機制抑制HBV RT。通過基于細胞轉染的復制效率測定發(fā)現KM