苦參堿對體外培養(yǎng)的大鼠視網膜微血管內皮細胞的增殖及VEGF表達的影響.pdf

1、目的：研究苦參堿（Matrine, Mat）對體外培養(yǎng)的大鼠視網膜微血管內皮細胞（rat retinal microvascular endothelial cells，RRMECs）的增殖及VEGF表達的影響，明確其可否抑制視網膜微血管內皮細胞的增殖及下調VEGF的表達，為視網膜新生血管的藥物防治提供新的思路和理論依據。 方法：原代培養(yǎng)RRMECs，取第三代細胞用于實驗。MTT比色法檢測不同劑量Mat作用不同時間對RRMECs

2、增殖的抑制作用；臺盼藍染色細胞計數法測定其對RRMECs生長曲線的影響；AO/EB熒光雙染色法觀察細胞凋亡形態(tài)學的改變。將RRMECs按如下分組處理： （1）陰性對照組：用含20％血清DMEM培養(yǎng)； （2）陽性對照組：含20％血清DMEM+血管抑素 130mg/L； （3）Mat組：含20％血清DMEM+Mat 40mg/L； （4）高糖組：含20％血清高糖DMEM（葡萄糖濃度 25mmol/L）；

3、 （5）Mat+高糖組。免疫細胞化學和Western-Blotting檢測不同分組處理48小時后細胞VEGF的表達。 結果： 1、MTT比色法測定結果顯示:用5、10、20、40、80、160mg/L的Mat處理RRMECs，作用24h細胞增殖抑制率分別為1.42±1.03％、11.50±1.98％、24.98±2.38％、40.27±2.49％、53.54±2.39％、63.88±3.12％;作用48h細胞增殖抑制率

4、分別為4.16±1.14％、14.40±1.78％、33.28±1.83％、53.61±1.32％、63.53±1.96％、73.79±1.12％;作用72h細胞增殖抑制率分別為9.83±2.13％、22.17±4.29％、42.65±1.05％、63.17±1.38％、74.35±2.60％、87.24±4.59％。在5mg/L以上各試驗組與對照組相比均具有顯著性差異（P<0.05)，各試驗組之間兩兩比較也具有顯著性差異（P<0.05

5、)。隨著濃度的增高，作用時間的增加， Mat抑制細胞增殖的作用越明顯，當濃度達到40mg/L，作用48小時，細胞抑制率超過了50％。細胞計數繪制生長曲線結果與MTT結果相一致。 2、AO/EB熒光雙染色法觀察:在 Mat濃度達到40mg/L后處理RRMECs呈現不同程度的細胞凋亡形態(tài)學特征。 3、免疫細胞化學結果顯示：VEGF表達定位于胞膜和胞漿,陽性部分為棕黃色顆粒。血管抑素（130mg/L）和Mat(40mg/L)處

6、理后其陽性表達明顯降低，灰度值越少（P<0.05）且兩者作用無明顯差別；高糖組的VEGF陽性表達最高，灰度值也最大，Mat(40mg/L)同樣能下調其表達（P<0.05）。 4、Western-Blotting半定量檢測VEGF蛋白的表達與免疫細胞化學的結果一致。 結論： 1、 Mat能有效地抑制體外培養(yǎng)的RRMECs的增殖，在一定的濃度和時間范圍內其抑制作用呈明顯的劑量和時間依賴性； 2、Mat 能有效