超聲微泡介導Smad3shRNA局部下調Smad3對單側輸尿管梗阻大鼠腎間質纖維化的治療作用.pdf

1、研究背景：
　　 轉化生長因子Beta(TGF-β)是公認的促腎間質纖維化的關鍵因子,由于TGF-β是一把雙刃劍,具有促纖維化和抗炎的作用,這是以抑制TGF-β抗纖維化的治療陷入困境。最近Smad3基因敲除小鼠提示:Smad3通路在間質纖維化形成中處于中心地位,這提示局部抑制該通路可用于臨床治療梗阻性腎病。RNAi沉默目的基因的特點能夠用來治療腎臟疾病,但用傳統(tǒng)的病毒載體和非病毒轉染方法把siRNA和shRNA導入腎臟,缺乏安全

2、性和有效性,其臨床應用會受限。
　　 第一部分超聲微泡系統(tǒng)介導基因轉染大鼠腎臟的實驗研究
　　 研究背景:安全性是人類臨床基因治療中最重要的主題,從這個觀點出發(fā),最好的是發(fā)展一種顯著的非病毒基因轉染方法,最近研究表明:超聲能引起細胞膜通透性并增加基因的轉染。目的:研究optison介導的靶向腎臟傳輸?shù)男屎拖嚓P條件.
　　 方法:健康雄性Wistar大鼠(由軍科院實驗動物中心提供),150 g左右,分為以下幾組:

3、
　　 1不同濃度optison微泡對轉染效率的影響:健康雄性Wistar大鼠54只(由軍科院實驗動物中心提供),150 g左右,分為對照組(C組,n=6)、超聲+CY5-ODN+0％optison組(0％組,n=6)、超聲+CY5-ODN+5％optiso組(5％組,n=6)、超聲+CY5-ODN+10％optison組(10％組,n=6)、超聲+CY5-ODN+25％optison組(25％組,n=6)超聲+CY5-ODN+

4、50％optison組(50％N,n=6)
　　 2不同時間對轉染效率的影響:Wistar大鼠30只以25％和50％的optison濃度照射1和2分鐘,對照組(C組,n=6)超聲+CY5-ODN+25％optison組(25％1分鐘組,n=6)超聲+CY5-ODN+25％optison組(25％2分鐘組,n=6)超聲+CY5-ODN+50％optison組(50％1分鐘組,n=6)超聲+CY5-ODN+50％optison組(5

5、0％2分鐘組,n=6)350％微泡1分鐘對轉染RFP-N1的影響:健康雄性Wistar大鼠36只(由軍科院實驗動物中心提供),150 g左右,分為對照組(C組,n=6)、超聲+RFP-N1+optison組(U+RFP-N1+微泡組,n=6)、超聲+RFP-N1+optison組(1天組,n=6)、超聲+RFP—N1+optison組(3天組,n=6)、超聲+RFP—N1+optison組(7天組,n=6)450％微泡1分鐘對轉染ODN

6、的抑制效果健康雄性Wistar大鼠36只(由軍科院實驗動物中心提供),150 g左右,分為對照組(C組,n=6)、超聲+CY5-ODN+optison組(U+ODN+微泡組,n=6)、超聲+CY5-ODN+optison組(1天組,n=6)、超聲+CY5-ODN+optison組(3天組,n=6)超聲+CY5-ODN+optison組(7天組,n=6)。并檢測血清中AST ALT尿素氮肌苷,LDH以評價基因轉染的生物學影響。并用RT-P

7、CR、Western blotting檢測了CY5-ODN抑制CTGF的效果。
　　 結果:cy50DN或RFP—N1基因轉染率在腎小球細胞是95％,血管和血管周圍細胞90％,髓質小管和間質細胞為70-80％?；蜣D染腎臟后血清學檢查肝腎功能沒有改變,盡管LDH有所升高,但在7天時已經(jīng)顯著下調(P<0.05)。轉染CY5-ODN能有效抑制CTGF的表達。
　　 結論:超聲聯(lián)合optison能夠顯著增強腎臟基因轉染的效率,

8、這種非病毒轉染方法治療用來治療腎臟疾病.
　　 目的:構建抑制Smad3的shRYA表達載體。
　　 方法:化學合成2段編碼短發(fā)夾RNA序列的、靶向Smad3的寡核苷酸,各64個堿基,退火,克隆到經(jīng)Bgl11、Hind111雙酶切同時CIP處理后的pSUPER載體的poly111 H1啟動子的下游,重組構建RNAi質粒,同時設立非特異對照。
　　 結果:重組構建的pSUPERSmad3載體經(jīng)雙酶切電泳分析及插入基

9、因片段序列分析,結果表明64個堿基成功插入到預計位點,并且序列完全一致。
　　 結論:載體的成功構建,為進一步研究其抑制Smad3的打下基礎。
　　 目的:該研究采用一種新近發(fā)展的顯著、高效和安全的非病毒轉染方法——超聲微泡轉導系統(tǒng),把編碼shRNA Smad3的pSUPER質粒局部轉染單側輸尿管梗阻大鼠腎臟,研究對腎間質纖維化的治療作用及機制.
　　 方法:將雄性Wistar大鼠隨機分成四組(n=6),①假手術

10、對照組(Sham)；②UUO不用藥組(UUO)；③UUO+超聲+optison+pSUPERshNC(control)(④UUO+超聲+optison+pSUPERshSmad3(shSmad3)；7天后處死大鼠觀察以下指標(1)PAS染色觀察病理改變,Masson’s染色觀察腎間質纖維化的面積；(2)用RT-PCR檢測Smad2、Smad3mRNA的表達,Northern blot檢測CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA

11、 mRNA的表達:用Western Blot檢測Smad2/3、Smad3、P-Smad3、CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA的蛋白表達；(3)免疫熒光檢測Smad2、Smad3、CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA的表達。
　　 結果:(1)PAS結果表明UUO或Control組出現(xiàn)嚴重的小管萎縮,小管間質單核細胞浸染及纖維化,shRNA smad3明顯減輕。(2)與Sham比較,UUO或Cont

12、rol組Smad2/smad3mRNA蛋白表達沒有顯著差別(p>0.05)而P—Smad3水平顯著增加(p<0.05),shRNA smad3能顯著減輕下調Smad3mRNA、蛋白表達水平及p—Smad3水平(p(0.05)而對Smad2mRNA、蛋白表達沒有顯著差別(p>0.05),進一步被免疫熒光證實。(3)與Sham比較,UUO或Control組CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMAmRNA蛋白表達水平顯著增加(p<0

13、.05),shRNAsmad3能顯著減輕下調CollagenⅡ、CollagenⅢ、α—SMAmRNA蛋白表達水平(p<0.05)進一步被免疫熒光及Masson's染色證實。結論:(1)超聲微泡介導shRNA smad3轉染能顯著抑制Smad3的表達及活化,并顯著減輕單側輸尿管梗阻大鼠腎間質纖維化；(2)TGF-β/Smad3信號通路在腎間質纖維化中具有重要作用；(3)超聲微泡介導shRNA smad3為進一步臨床防止纖維化疾病提供了新