氯離子通道-3在內皮素-1對牛角膜內皮細胞影響中的作用.pdf

1、目的:探討體外培養(yǎng)牛角膜內皮細胞的最佳方法，并研究內皮素-1(ET-1)對其增殖和移行的影響及氯離子通道-3(chloridechannel3，CLC-3)在其中的作用。 方法:采用2種培養(yǎng)方法和4種培養(yǎng)基體外培養(yǎng)牛角膜內皮細胞。通過損傷模型檢測細胞移行。采用免疫組化染色法、MTT法和流式細胞儀檢測PCNA表達、細胞增殖和細胞周期變化。免疫熒光測定CLC-3蛋白的表達部位。應用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、免疫印跡(Wes

2、ternblot)方法檢測CLC-3mRNA和蛋白的表達。采用反義核酸技術，觀察CLC-3基因在ET-1對體外培養(yǎng)牛角膜內皮細胞影響中的作用。 結果:顯微分離后彈力膜及內皮細胞層聯(lián)合延遲消化培養(yǎng)法，體外培養(yǎng)牛角膜內皮細胞成功率高。采用DMEM/F12(1：1)培養(yǎng)基，細胞貼壁、生長、形態(tài)和活性最好。細胞在轉錄和翻譯水平均有內源性CLC-3基因表達，表達產物定位于細胞膜和部分細胞漿。ET-1呈劑量相關性的促進培養(yǎng)的牛角膜內皮細胞增

3、殖和移行，聯(lián)合應用重組人表皮生長因子(rhEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)對細胞增殖有協(xié)同作用。ET-1劑量依賴性增加CLC-3mRNA及蛋白的表達，氯通道阻斷劑5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸(5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoicacid，NPPB)和CLC-3反義寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide，AS-ODN)濃度依賴性抑制ET-1促進細胞增