多重實時熒光定量PCR檢測人博卡病毒的價值.pdf

1、目的：建立多重實時熒光定量PCR檢測人博卡病毒1-3型（HBoV1-3）的檢測方法，并通過與普通PCR比較及測序來評估其特異性和敏感性；運用該檢測方法對2009-2010年急性下呼吸道感染住院兒童的鼻咽抽吸物（NPAs）標本進行HBoV檢測、測序分型，并對相關臨床資料進行總結分析，以了解 HBoV1-3型在長沙地區(qū)急性下呼吸道感染兒童中的流行特點，為本地區(qū)兒童呼吸道感染的防治及進一步的研究奠定基礎。
　　方法：⑴根據(jù)文獻獲得并合成

2、HBoV1-3型引物、探針的基因序列，確定反應體系。⑵選取3例已知的陽性標本HBoV1、HBoV2、HBoV3各一份，經(jīng)普通PCR擴增，陽性擴增產(chǎn)物測序鑒定，目的基因與載體連接、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞并增菌、提取質(zhì)粒，測序確定含有目的基因的質(zhì)粒，評估質(zhì)粒質(zhì)量后十倍梯度稀釋，制作標準曲線。⑶質(zhì)粒稀釋成101-108的標準品，通過多重實時熒光定量PCR進行擴增，評估靈敏度；選取已知分別含有不同的1種DNA和10種RNA病毒的標本、多重病毒混合

3、標本、含有肺炎支原體和衣原體的標本、不含病毒的標本以及滅菌去離子水進行檢測，評估特異性；對同一HBoV陽性標本同時進行5次測定以及連續(xù)5天對同一樣本進行重復測定，評估重復性。⑷收集2009年9月1日至2010年10月31日在湖南省人民醫(yī)院兒科醫(yī)學中心因急性下呼吸道感染住院兒童的NPAs標本。⑸隨機選取在湖南省人民醫(yī)院兒科醫(yī)學中心因急性下呼吸道感染住院兒童的NPAs標本進行多重實時熒光定量PCR和普通PCR檢測，評價它們檢測臨床標本的敏感

4、性和特異性。⑹收集的NPAs標本經(jīng)提取核酸后通過建立的多重實時熒光定量 PCR檢測 HBoV1-3，同時采用PCR、RT-PCR及半巢式PCR方法檢測RSV、HRV、IFVA/B、PIV1/2/3、hMPV、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、ADV，并測序驗證。⑺對2009-2010年急性下呼吸道感染住院兒童HBoV陽性檢出病例的病例資料進行分析。
　　結果：①多重實時熒光定量 PCR檢測 HBoV不同梯度定量模板的拷貝對數(shù)

5、值與Ct值之間呈良好的線性關系，其相關系數(shù)分別為0.999、0.999和0.998；重復性好，批內(nèi)CV值為0.95％，批間CV值在102-106拷貝/反應范圍波動在0.9%-2%，均小于5%；此方法的靈敏度可達到10拷貝/反應（最小濃度3.38×10拷貝/反應）。且對其它呼吸道常見病毒以及肺炎支原體、肺炎衣原體進行檢測，均無擴增曲線，特異性好。②多重實時熒光定量PCR與普通PCR對171份NPAs進行了HBoV平行檢測，多重實時熒光定量

6、PCR檢出27份陽性，普通 PCR檢出16份陽性，且所有普通PCR陽性樣本均存在于多重實時熒光定量PCR檢測的陽性樣本中，兩種方法檢測的陽性產(chǎn)物均進行測序鑒定，多重實時熒光定量PCR檢出的27份陽性標本中有4份為假陽性。③2009年9月1日～2010年10月31日共收集急性下呼吸道感染住院兒童的NPAs標本775份，其中檢出HBoV陽性110例，總檢出率為14.19%；HBoV1檢出107例，檢出率為13.80%；HBoV2檢出3例，檢

7、出率為0.39%；未檢出HBoV3。在110例HBoV陽性檢出病例中，男性患兒的檢出率為14.26%，女性患兒的檢出率為14.07%，男女之比為1.01：1，無性別差異（χ2=0.005，P=0.944）。HBoV陽性患兒的年齡在22天-13歲2月之間，平均年齡為18個月。5歲以下占96.36%，3歲以下占86.36%。夏季檢出33例（1例為HBoV2）、春季30例（2例為HBoV2）、冬季26例、秋季21例。HBoV陽性檢出病例主要的

8、診斷為支氣管肺炎、毛細支氣管炎和支氣管哮喘并肺部感染。在檢測的所有 HBoV陽性標本中，34.54%的為單獨感染，65.45%的為混合感染，在單一 HBoV陽性病例中發(fā)熱者混合其他病毒陽性的病例常見（P=0.016）；而HBoV混合其它病毒陽性檢出病例中有基礎疾病的例數(shù)多于單一HBoV檢出病例（P=0.015），其他臨床情況比較差異無統(tǒng)計學意義。
　　結論：⑴成功構建了多重實時熒光定量PCR檢測HBoV1-3的方法。⑵多重實時熒光