基于高通量測序的核酸編碼技術研究及其在miRNA分析中的應用.pdf

1、核酸編碼技術,是指人為對核酸序列(包含核苷酸單體)的序列排布、修飾的方式和種類等進行設計,使核酸序列具有攜帶額外信息的能力。高通量測序技術作為一種快速而有效的序列測定技術,自2005年問世以來在生命科學研究中扮演著越來越重要的角色。然而,較低的樣本并行分析能力制約了高通量測序技術在以miRNA樣本為代表的較低復雜度樣本中的應用,同時,較長的測序運行時間也影響該技術得到更廣泛應用。核酸編碼技術,通過對高通量測序技術使用的核酸序列和核苷酸單

2、體進行設計和改造,為高通量測序技術性能的提升提供了一條新的思路。本論文以高通量測序技術中的核酸序列和核苷酸單體為研究對象,旨在提升高通量測序的技術指標,特別是樣本并行分析能力和測序運行時間,拓寬高通量測序技術的應用范圍。
　　 1.用于SOLiD測序平臺的miRNA文庫制備方法研究現有的基于SOLiD高通量測序平臺的miRNA文庫制備方案,由于使用一對雙鏈接頭,在文庫制備的同一步驟加入反應體系,會在測序文庫中產生較高數量的接頭自

3、連接序列。本論文對該方案進行了改進,采用一對單鏈RNA接頭,分別只具有5'末端和3'具有連接活性。接頭分兩輪連接到miRNA樣本的兩側,每輪連接反應僅使用一條接頭,每步連接之后應用凝膠電泳對文庫進行長度選擇和純化。研究結果表明,改進后的方案減少了71％的接頭自連接序列,為利用SOLiD測序平臺研究miRNA提供了更加高效的研究方法。
　　 2.雙標簽編碼的高通量測序miRNA文庫制備方法研究在一張測序芯片上,高通量測序技術已經能

4、夠并行分析超過10億個DNA片段。這使得高通量測序技術應用于諸如miRNA這類較低復雜度的樣本(較低測序通量需求)時顯得不夠高效和經濟。針對這一問題,發(fā)展了雙核酸標簽編碼的樣本制備技術,該技術在測序樣本的兩側各設計了一條核酸標簽,利用這對核酸標簽編碼確定樣本信息。使用12種標簽完成了對32個miRNA樣本的并行分析。研究結果表明,雙標簽編碼方案能夠制備可靠的miRNA文庫,特別適用于大量樣本的并行分析。
　　 3.雙標簽編碼mi

5、RNA測序方法的生物信息學研究雙標簽編碼的miRNA測序方法面臨如何選擇合適的核酸編碼標簽,如何快速高效地從測序數據中挖掘有用信息等生物信息學挑戰(zhàn)。針對這些挑戰(zhàn),設計了一組長為6位的核酸標簽序列,開發(fā)了一套適用于雙標簽編碼的數據處理流程,重點研究了解碼流程和miRNA歸一化方法。研究結果表明,所提供的115種核酸標簽序列能夠準確分辨標簽種類;所設計的解碼流程可實現對雙標簽編碼方案測序結果的精確解碼;經比較,分位數-分位數法具有更好的歸一

6、化效果。
　　 4.基于雙標簽編碼的乳腺癌相關樣本miRNA表達研究乳腺癌是全世界婦女最常見的癌癥,為了研究miRNA在乳腺癌樣本的表達情況,基于高通量測序的雙標簽編碼miRNA文庫制備方案和數據處理流程,研究了乳腺癌相關樣本的miRNA表達情況。在對miRNA進行篩選后,共發(fā)現22種miRNA在26個乳腺癌樣本和6個乳腺良性組織樣本間存在表達水平差異。這一篩選為后續(xù)研究乳腺癌與miRNA的相關性奠定了一定的基礎。
　　

7、 5.信號組合編碼的測序探針技術研究現有的使用熒光基團標記測序探針(包含核苷酸單體)的測序平臺中,大多采用最基本熒光基團與測序探針一對一和一對多的編碼方式,只能在一輪反應中測定一位堿基的序列信息。設計了信號組合編碼的測序探針方案,對多種標記物進行組合后,采用每種組合方式標記一種或一類核酸序列(包括核苷酸單體)。在迷你測序證明了方案的可行性,并表明信號組合編碼方案能夠應用于高通量測序平臺。該方法是目前國際上唯一可以在一輪測序反應測定2位堿