血小板源生長因子受體α在瘢痕疙瘩形成中的作用機(jī)制.pdf

1、目的：研究血小板源生長因子受體α(PDGFR-α)在瘢痕疙瘩形成中的作用及其內(nèi)在機(jī)制。方法：檢測PDGFR-α在體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，并與正常皮膚成纖維細(xì)胞作對照；觀察PDGFR-α對細(xì)胞增殖和膠原合成的影響；觀察PDGFR-α激活對細(xì)胞內(nèi)ERK通路激活的誘導(dǎo)。結(jié)果：PDGFR-α在體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于正常皮膚成纖維細(xì)胞，這種高表達(dá)顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成，PDGFR-α激活后主要通過細(xì)胞內(nèi)E

2、RK通路來傳遞促細(xì)胞增殖和膠原合成的信號。結(jié)論：PDGFR-α高表達(dá)對促進(jìn)瘢痕疙瘩形成有重要意義。 一、研究背景瘢痕疙瘩是人類特有的一種病理現(xiàn)象，其造成的外形破壞和功能障礙是目前整形外科治療中急待解決的難題。其形成機(jī)制復(fù)雜，雖然國內(nèi)外學(xué)者已從多方面對瘢痕疙瘩進(jìn)行了廣泛的研究，但其病因機(jī)制仍不清楚?，F(xiàn)已確定瘢痕疙瘩是以成纖維細(xì)胞旺盛增殖和以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)過度合成、沉積為特征的纖維化疾病，而且發(fā)現(xiàn)多種促纖維化細(xì)胞因子在瘢痕疙瘩

3、的形成中起重要作用。血小板源生長因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)是體內(nèi)一種主要促有絲分裂劑，可以刺激成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種組織細(xì)胞增殖、趨化及遷移，與肺纖維化、腎小球腎炎、硬皮病等多種纖維化疾病都密切相關(guān)。PDGF是由多種異構(gòu)體組成的家族，通過特異性結(jié)合并激活靶細(xì)胞膜上的血小板源生長因子受體(platelet-derivedgrowthfactorreceptor，PDGFR)而發(fā)揮作用，

4、PDGFR是一種跨膜糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶活性，可分為α、β兩種亞基，PDGFR-α和PDGFR-β結(jié)構(gòu)相似，但在不同種類細(xì)胞中的表達(dá)卻存在很多差異性，在細(xì)胞中的表達(dá)水平也不恒定，在體內(nèi)介導(dǎo)的功能之間的差異性更為明顯。已有報道瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞對PDGF促細(xì)胞增殖和膠原合成的反應(yīng)性都高于正常，這種高反應(yīng)性可能是由瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞受體水平升高所介導(dǎo)，但具體機(jī)制不明，不同研究對于瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中是否存在PDGFR表達(dá)增高、何種受體

5、表達(dá)增高等都存在分歧。 近年來，隨著現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，病理性瘢痕增生與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)系的研究也逐漸受到人們重視。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是指細(xì)胞外的刺激信號通過細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)的一系列信號分子和生化級聯(lián)反應(yīng)傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)的靶分子，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞增殖、分化、凋亡、粘附及物質(zhì)合成等生物學(xué)效應(yīng)的一系列生物活性反應(yīng)過程。生命過程就是以細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為基礎(chǔ)的生物化學(xué)反應(yīng)過程，創(chuàng)傷后病理性瘢痕增生是由于參與修復(fù)的細(xì)胞增殖大于凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)合成

6、大于降解而形成的，這必然涉及細(xì)胞對各種刺激的反應(yīng)－細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程?，F(xiàn)已開展關(guān)于惡性腫瘤、動脈粥樣硬化等許多疾病發(fā)生過程中PDGF及其受體家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的研究，但對于瘢痕疙瘩形成過程中PDGF及其受體家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的研究卻還是空白。 二、研究目的 (1)檢測PDGFR-α、PDGFR-β在體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞中蛋白及mRNA水平的表達(dá)。 (2)檢測PDGFR-α在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中

7、表達(dá)升高對成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的影響。 (3)檢測PDGFR-α磷酸化對成纖維細(xì)胞內(nèi)ERK通路的激活情況以及ERK通路激活對成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的影響。 (4)了解PDGFR-α在瘢痕疙瘩形成中的作用機(jī)制，為探索新的防治方法提供思路。 三、研究內(nèi)容和方法(1).切取瘢痕疙瘩標(biāo)本和包皮正常皮膚標(biāo)本進(jìn)行成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)，將第3代細(xì)胞用于實驗，分別采用免疫細(xì)胞化學(xué)、實時定量PCR和westernblot方法檢

8、測了PDGFR-α、PDGFR-β在蛋白質(zhì)及mRNA水平的各自表達(dá)。 (2)應(yīng)用不同濃度的PDGFR-α刺激劑PDGF-AB對體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)處理，并分別通過MTT和3H脯氨酸摻入法檢測兩組成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成。 (3)應(yīng)用不同濃度的PDGFR-α抑制劑AG1296對體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)處理，并分別通過MTT和3H脯氨酸摻入法檢測兩組成纖維細(xì)

9、胞增殖和膠原合成。 (4)采用westernblot方法分別檢測PDGF-AB刺激后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞中PDGFR-α及ERK通路關(guān)鍵酶MEK、ERK1/2、Elk-1的磷酸化水平。 (5)應(yīng)用不同濃度的選擇性ERK磷酸化抑制劑PD98059對體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)處理，通過MTT和3H脯氨酸摻入法檢測細(xì)胞增殖和膠原合成。 四、研究結(jié)果 (1)免疫細(xì)胞

10、化學(xué)染色顯示瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的PDGFR-α和PDGFR-β的染色較正常皮膚成纖維細(xì)胞增強(qiáng)，PDGFR-α的染色增強(qiáng)尤其明顯。圖像定量分析顯示瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中PDGFR-α表達(dá)的陽性指數(shù)顯著大于正常皮膚成纖維細(xì)胞，而瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中PDGFR-β表達(dá)的陽性指數(shù)與正常皮膚組成纖維細(xì)胞比無顯著性差異。通過比較westernblot的積分光密度值，顯示PDGFR-α在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中蛋白表達(dá)顯著高于正常皮膚成纖維細(xì)胞，而PDG

11、FR-β在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的蛋白表達(dá)與正常皮膚成纖維細(xì)胞相比未見顯著升高。通過比較實時定量PCR每百萬看家基因含量，顯示與正常皮膚組成纖維細(xì)胞相比，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中PDGFR-α的mRNA表達(dá)顯著升高，而PDGFR-β的mRNA表達(dá)升高不顯著。 (2)通過MTT和3H脯氨酸摻入法檢測，顯示在無PDGF-AB干預(yù)條件下，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成都顯著高于正常皮膚成纖維細(xì)胞。PDGF-AB以劑量依賴方式增加兩組成纖

12、維細(xì)胞的細(xì)胞增殖和膠原合成，PDGF-AB對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的飽和濃度明顯高于正常皮膚成纖維細(xì)胞，兩組成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成差異隨著PDGF-AB濃度的增加而擴(kuò)大。 (3)通過MTT和3H脯氨酸摻入法檢測，顯示在無AG1296干預(yù)條件下，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成都顯著高于正常皮膚成纖維細(xì)胞。AG1296以劑量依賴方式減少兩組成纖維細(xì)胞的細(xì)胞增殖和膠原合成，但AG1296對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的飽和濃度明顯高于正常皮膚

13、成纖維細(xì)胞，經(jīng)一定濃度AG1296作用后可以消除兩組成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成之間的差異。 (4)通過westernblot檢測，顯示PDGF-AB刺激以劑量依賴方式升高PDGFR-α及ERK通路3個關(guān)鍵酶MEK、ERK1/2、Elk-1的磷酸化水平，而且在同等濃度PDGF-AB刺激下瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中PDGFR-α及上述酶的磷酸化水平顯著高于正常皮膚成纖維細(xì)胞。 (5)通過MTT和3H脯氨酸摻入法檢測，顯示PD9805

14、9以劑量依賴方式抑制PDGF-AB誘導(dǎo)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞增殖，但PD98059對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的飽和濃度高于正常皮膚成纖維細(xì)胞。PD98059以非劑量依賴方式抑制PDGF-AB誘導(dǎo)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞膠原合成。 五、研究結(jié)論瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中PDGFR-α的mRNA和蛋白表達(dá)水平都顯著高于正常皮膚成纖維細(xì)胞，而兩組成纖維細(xì)胞中PDGFR-β的表達(dá)則無顯著性差異。瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中