家蠅幼蟲抗菌肽Defensin基因的克隆、表達與活性初步研究.pdf

1、廣東醫(yī)學院碩士學位論文家蠅幼蟲抗菌肽Defensin基因的克隆、表達與活性初步研究姓名：許琴英申請學位級別：碩士專業(yè)：臨床檢驗診斷學指導教師：朱家勇20050501家蠅幼蟲抗菌肽D e f e n s i n 基因的克隆表達與活性初步研究摘 要【目的】昆蟲防御素( I n s e c t D e f e n s i n s ) 是昆蟲體內免疫系統(tǒng)產生的一類陽離子肽，對細菌、真菌等微生物具有廣譜的殺傷作用，是目前生命科學研究的一個熱點。天

2、然昆蟲防御素來源有限，很難滿足科研和應用的需要，采用傳統(tǒng)方法大量制備很困難，而人工合成成本高，因此通過基因工程途徑大規(guī)模生產防御素是一種理想途徑。本論文運用生物信息學和分子生物學技術，在對家蠅幼蟲D e f e n s i n 基因進行克隆分析的基礎上，采用原核和真核表達系統(tǒng)對目的基因進行表達，表達產物經親和層析分離純化后，以大腸桿菌為受試對象，對目的蛋白的抑菌活性進行初步研究?！痉椒ā縧 ，D e f e n s i n ：基因的克隆

3、分析用大腸桿菌( E s c h e r i c h i a , c o l i ) 和金黃色葡萄球菌( S t a p , b y f 0 C 0 ( - C U Sa u r e u s ) 免疫家蠅t ( m u s c a d o m e s t i c a ) 三_ 蛉幼蟲，4 8 h 后采用T R I z o H 試劑提取總R N A 。根據G e n B a n k 上公布的家蠅成蟲防御素基因，利用P r i m e rP

4、 r e m i e r 5 ．0 生物學軟件設計～對特異性引物進行R T - P C R 。P C R I 產物克隆至t i p U C m - T 載體上，酶切和P C R J 鑒定后測序，運用生物信息學對目的基因進行序列分析并預測其編碼蛋白的結構及理化性質。2 ．D e f e n s i n 基因的原核表達及活性鑒定采用克隆技術，構建D e f e n s i n g [ ] 的原核表達載體，獲得融合組氨酸( 6 ×H

5、 i s )標簽的重組質粕：p E T 3 0 a ( + ) ／D e f e n s i n 和融合谷胱甘肽( G S T ) 標簽的重組質粒p G E X ．- 4 T - 1 ／D e f e n s i n 。轉化大腸桿菌宿主細胞進行誘導表達，表達過程中對I P T G濃度、誘導溫度和時間進行優(yōu)化。采用親和層析法分離純化融合蛋白，S D S ．．P A G E和W e s t e m b l o t t i n g 鑒定目的蛋