CRH兩型受體對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元突起發(fā)育相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、海馬是中樞邊緣系統(tǒng)的重要腦區(qū),機體的許多生理功能如學(xué)習(xí)記憶等與其有著密切的關(guān)系。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)是下丘腦分泌的多肽類激素。近年來發(fā)現(xiàn),CRH作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)/調(diào)質(zhì),能通過其受體在情緒反應(yīng)、學(xué)習(xí)記憶以及神經(jīng)系統(tǒng)損傷與發(fā)育等方面發(fā)揮重要的生理作用。CRH受體分為兩型:CRHR1和CRHR2,它們介導(dǎo)了海馬不同的生理功能。目前,有關(guān)CRH兩型受體對海馬神經(jīng)元突起發(fā)育的調(diào)節(jié)作用及其內(nèi)在機制尚未完全闡明。
   前

2、期研究顯示,CRH能促進海馬神經(jīng)元突起發(fā)育,但CRH這種作用所涉及的受體機制尚不清楚。因此,我們以原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元為研究對象,觀察CRH兩型受體對海馬神經(jīng)元突起發(fā)育的調(diào)節(jié)作用。其次,我們研究了CRH兩型受體調(diào)節(jié)神經(jīng)元樹突發(fā)育可能涉及的相關(guān)分子。本課題選擇了兩類神經(jīng)元突起發(fā)育相關(guān)蛋白,塌陷反應(yīng)介導(dǎo)蛋白3(CRMP3)以及動力蛋白類似蛋白1(MKLP1),觀察CRH兩型受體對它們的調(diào)節(jié)作用;并進一步給予PKA、PLC、PKC等蛋白激

3、酶的抑制劑和激動劑,研究CRH兩型受體作用的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。
   主要實驗結(jié)果如下:
   一、CRH兩型受體對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元突起發(fā)育的調(diào)節(jié)
   應(yīng)用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將增強型綠色熒光蛋白(EGFP)轉(zhuǎn)入原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元中,觀察到CRH能增加神經(jīng)元樹突總長度(TDBL),而CRH這種作用能被CRHR1特異性的拮抗劑Antalarmin所阻斷,但不能被CRHR2特異性的拮抗劑Astressin2B所阻

4、斷,提示CRHR1激活能促進海馬神經(jīng)元樹突發(fā)育。而僅對CRHR2具有親合力的UrocortinⅡ能減少神經(jīng)元TDBL,提示CRHR2激活能抑制海馬神經(jīng)元樹突發(fā)育。
   二、CRH兩型受體對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元突起發(fā)育相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)
   (一)CRH兩型受體對海馬神經(jīng)元CRMP3的調(diào)節(jié)
   1.免疫熒光細胞化學(xué)結(jié)果顯示,原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元上表達CRMP3蛋白。
   2.熒光實時定量PCR和Wes

5、tern blot的結(jié)果顯示,CRH能減少海馬神經(jīng)元CRMP3 mRNA和蛋白的表達,呈劑量依賴關(guān)系;進一步研究還證實,CRH對CRMP3表達的調(diào)節(jié)作用能被CRH受體廣譜的拮抗劑Astressin或CRHR2特異性的拮抗劑Astressin2B所阻斷,但不能被CRHR1特異性的拮抗劑Antalarmin阻斷;而僅對CRHR2具有親合力的UrocortinⅡ能下調(diào)CRMP3的表達;時間曲線顯示,UrocortinⅡ在6hr內(nèi)即可誘導(dǎo)CRM

6、P3 mRNA的表達減少,12hr到達最低值,36hr后仍低于對照組。以上結(jié)果說明,CRHR2激活能抑制海馬神經(jīng)元CRMP3的表達。
   3.Western blot法證實,UrocortinⅡ可增加海馬神經(jīng)元磷酸化PLC-β3的表達,而這個作用能被Astressin2B所阻斷。以上結(jié)果證實,CRHR2能激活PLC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
   4.分別給予AC抑制劑SQ22536、PKA抑制劑H89、PLC抑制劑U73122和

7、PKCα/β抑制劑G(o)6976,我們發(fā)現(xiàn)UrocortinⅡ?qū)RMP3表達的下調(diào)作用可以被U73122或G(o)6976所阻斷,但不受SQ22536或H89的影響,提示CRHR2抑制海馬神經(jīng)元CRMP3水平的作用主要涉及PLC/PKC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,與AC/PKA通路無關(guān)。
   (二)CRH兩型受體對海馬神經(jīng)元MKLP1的調(diào)節(jié)
   1.免疫熒光細胞化學(xué)結(jié)果顯示,原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元上表達MKLP1蛋白。

8、>   2.Western blot法證實,CRH可增加海馬神經(jīng)元MKLP1蛋白的表達,呈劑量依賴關(guān)系。進一步研究還證實,CRH誘導(dǎo)MKLP1蛋白表達增加的作用能被Antalarmin所阻斷,但不能被Astressin2B阻斷。以上結(jié)果說明,CRHR1激活能誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元MKLP1蛋白表達的增加。
   3.分別給予SQ22536、H89、U73122和G(o)6976,觀察到它們都不能阻斷CRHR1對MKLP1誘導(dǎo)表達的作用

9、。進一步研究還證實,CRHR1這一誘導(dǎo)作用也不能被ERK抑制劑PD98059、JNK抑制劑SP600125和p38抑制劑SB203580所阻斷。以上結(jié)果說明,PLC/PKC、AC/PKA和MAPK通路皆不參與CRHR1對MKLP1表達的調(diào)節(jié)作用。
   結(jié)論:
   以上結(jié)果表明:CRH兩型受體對原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元樹突發(fā)育具有不同的調(diào)節(jié)作用,其中CRHR1激活能促進海馬神經(jīng)元樹突的發(fā)育,而CRHR2的作用則相反。此

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