低溫、手術(shù)創(chuàng)傷對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響.pdf

1、前言
　　 Tau蛋白是一種具有生理功能的可溶性蛋白,能夠與微管蛋白結(jié)合,在神經(jīng)元及軸突的生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要作用。二十世紀(jì)80年代最早有報(bào)道描述了tau蛋白,后來(lái)不斷發(fā)現(xiàn)tau蛋白還有高度磷酸化和神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles(NFTs))的形式存在。在以后20年里,NFT被認(rèn)為是神經(jīng)退行性變的病理基礎(chǔ)。但是,許多研究中發(fā)現(xiàn),NFT形成之前的高度磷酸化tau蛋白的聚集同樣導(dǎo)致記憶紊亂,利用轉(zhuǎn)基因鼠的

2、研究也提示,其空間記憶的損害與tau病理有關(guān)。全身麻醉藥能夠明顯地?fù)p害正常的體溫調(diào)節(jié),導(dǎo)致圍手術(shù)期低溫。有關(guān)圍手術(shù)期低溫引起的生化改變,以及對(duì)tau病理和學(xué)習(xí)記憶的影響卻知之甚少。已有研究報(bào)道了麻醉對(duì)鼠腦tau蛋白磷酸化的影響,發(fā)現(xiàn)并非麻醉本身,而是繼發(fā)于麻醉的低溫抑制了磷酸酶活性,從而導(dǎo)致tau蛋白磷酸化。
　　 近些年,術(shù)后認(rèn)知功能障礙逐漸成為研究熱點(diǎn),但是,對(duì)于體內(nèi)有關(guān)炎性反應(yīng)影響tau病理,從而引發(fā)學(xué)習(xí)記憶改變的研究并不

3、多見(jiàn)。關(guān)于炎性因子對(duì)嚙齒類認(rèn)知功能的影響的研究提示,對(duì)于老年鼠,小手術(shù)即可以引發(fā)夸大的神經(jīng)炎性反應(yīng),但并不損害其Morris水迷宮的測(cè)試能力,另一研究提示,手術(shù)引發(fā)了大鼠短暫的認(rèn)知下降,并且伴隨有短暫的海馬內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞的激活和促炎性因子的釋放。
　　 糖原合酶-3β(glycogen synthase kinase-3beta,GSK-3β)是AD大腦中神經(jīng)纖維纏結(jié)形成之前的一個(gè)重要的磷酸化tau蛋白的激酶。GSK-3β能夠促進(jìn)小

4、膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)炎癥的反應(yīng),而利用其抑制劑可以局限這種反應(yīng)。在人類包涵體肌炎的細(xì)胞中,利用氯化鋰抑制GSK-3β的活性可以減輕tau蛋白的磷酸化,GSK-3β和tau蛋白的共同定位,進(jìn)一步說(shuō)明GSK-3β在tau病理中的作用。因此,我們探究了手術(shù)創(chuàng)傷引發(fā)的免疫反應(yīng)是否增加神經(jīng)炎性反應(yīng)和認(rèn)知損害,而且,我們更關(guān)注于炎性因子是否通過(guò)GSK-3β介導(dǎo)tau病理。
　　 雖然低溫可能對(duì)危重病人有利,但是圍手術(shù)期由麻醉帶來(lái)的低溫對(duì)大多數(shù)病人是有

5、害的。低溫雖然沒(méi)有引起明顯的神經(jīng)損害,但是可能帶來(lái)認(rèn)知功能障礙。本研究旨在利用Y-迷宮對(duì)大鼠工作記憶和參考記憶進(jìn)行測(cè)試,探討暴露于臨床相關(guān)濃度的異氟烷是否導(dǎo)致tau蛋白高度磷酸化以及是否帶來(lái)記憶損害。同時(shí),我們測(cè)試了給與或不給予氯化鋰處理的脾切除鼠的空間記憶能力,試圖揭示圍手術(shù)期低溫以及炎性因子對(duì)術(shù)后認(rèn)知功能的影響機(jī)制。
　　 材料和方法
　　 雄性成年SD大鼠購(gòu)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,6月齡,體重350-400g,

6、動(dòng)物在22-23℃環(huán)境中自由活動(dòng),12:12小時(shí)日夜循環(huán),自由進(jìn)食水。大鼠吸入異氟烷麻醉誘導(dǎo)后氣管插管,機(jī)械通氣維持異氟烷濃度為1.3％-1.5％,期間監(jiān)測(cè)大鼠心電圖及直腸溫。
　　 實(shí)驗(yàn)一:大鼠隨機(jī)分為三組:健康對(duì)照組(group A；n=15)無(wú)任何干預(yù)措施。麻醉保溫組(group B；n=60),大鼠異氟烷麻醉后利用加溫?fù)幢３煮w溫在36.0-37.0℃。麻醉低溫組(group C；n=60),大鼠麻醉后暴露于22℃室溫。麻

7、醉后大鼠自然蘇醒分籠飼養(yǎng)。B,C組大鼠分別于2h麻醉后即刻,麻醉后1,3,7天(15只/時(shí)點(diǎn))處死,標(biāo)記為B0,B1,B3,B7,C0,C1,C3,和C7。
　　 實(shí)驗(yàn)二:大鼠隨機(jī)分為三組:健康對(duì)照組(group A；n=15)無(wú)任何干預(yù)措施。手術(shù)保溫組(group B；n=45),大鼠異氟烷麻醉后利用加溫墊保持體溫在36.0-37.0℃,行脾切除。手術(shù)低溫組(group C；n=45),大鼠麻醉后暴露于22℃室溫行脾切除。B,

8、C,組所有動(dòng)物均麻醉2小時(shí),B,C組手術(shù)后1,3,7天處死(15只/時(shí)點(diǎn))。B,C組動(dòng)物每個(gè)時(shí)點(diǎn)標(biāo)記為B1,B3,B7,C1,C3和C7。
　　 實(shí)驗(yàn)三:大鼠隨機(jī)分為三組:健康對(duì)照組(group A；n=15)無(wú)任何干預(yù)措施。手術(shù)和氯化鈉組(group C；n=45),異氟烷麻醉后脾切除,腹腔注射氯化鈉。手術(shù)和氯化鋰組(group D；n=45),異氟烷麻醉后脾切除,腹腔注射氯化鋰。B,C組所有動(dòng)物均麻醉2小時(shí),期間保持體溫36

9、-37℃,B,D組手術(shù)后1,3,7天處死(15只/時(shí)點(diǎn))。B,C組動(dòng)物每個(gè)時(shí)點(diǎn)標(biāo)記為B1,B3,B7,C1,C3和C7。
　　 利用Y-迷宮電刺激儀測(cè)試大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力。免疫組織化學(xué)方法定位磷酸化tau蛋白,total tau蛋白以及GSK-3β表達(dá)。蛋白印跡分析方法檢測(cè)磷酸化tau蛋白,total tau蛋白,IL-1β蛋白,TNF-α蛋白以及GSK-3β表達(dá)變化。利用絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶測(cè)定系統(tǒng)進(jìn)行蛋白磷酸酶2A(PP

10、2A)活性測(cè)定。實(shí)時(shí)定量PCR分析IL-1βmRNA和TNF-αmRNA變化。
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。利用SPSS13.0軟件分析,同組間參數(shù)分析利用t檢驗(yàn),不同組間參數(shù)比較利用單因素或多因素方差分析,后繼Dunnett檢驗(yàn),P<0.05認(rèn)為有顯著性差異。
　　 結(jié) 果
　　 實(shí)驗(yàn)一:異氟烷麻醉后2h誘發(fā)低體溫,大鼠直腸溫度可以最低下降到26.0℃。麻醉期間的低溫誘發(fā)麻醉后1天工作記憶的短暫損害。室溫

11、下暴露于異氟烷誘發(fā)大鼠腦內(nèi)tau蛋白磷酸化,Thr205位點(diǎn)和Ser396位點(diǎn)與對(duì)照組比較分別增加了10倍和2.9倍,但total tau沒(méi)有顯著變化。高度磷酸化。Thr-205和total tau抗體雙染表達(dá)定位于海馬CA1區(qū)。當(dāng)麻醉鼠進(jìn)行保溫處理時(shí),磷酸化位點(diǎn)恢復(fù)到對(duì)照組水平。麻醉誘發(fā)的低溫抑制大鼠腦內(nèi)PP2A活性下降45％,保溫后活性恢復(fù)。
　　 實(shí)驗(yàn)二:麻醉后低溫接受手術(shù)大鼠,術(shù)后1,3天工作記憶短暫損害。麻醉后保溫接受

12、手術(shù)大鼠,術(shù)后3天工作記憶短暫損害。手術(shù)后3天大鼠腦內(nèi)tau蛋白Thr205位點(diǎn)和Ser396位點(diǎn)磷酸化與對(duì)照組比較分別增加了2.7倍和1.1倍,但totaltau沒(méi)有顯著變化。高度磷酸化Thr-205和GSK-3β抗體雙染表達(dá)定位于海馬CA1區(qū)。與對(duì)照組比較,術(shù)后第1,3天手術(shù)保溫組IL-1βmRNA分別增加1.6倍和60％,手術(shù)低溫組增加17.3倍和1.6倍。術(shù)后1天手術(shù)保溫組和低溫組TNF-αmRNA的表達(dá)分別增加0.32和1倍,

13、第3天低溫組TNF-αmRNA的表達(dá)增加0.6倍。術(shù)后1天,保溫組和低溫組IL-1β蛋白表達(dá)分別增加0.73和1.35倍。TNF-α蛋白表達(dá)沒(méi)有顯著變化。在手術(shù)組大鼠,GSK-3β激活,表現(xiàn)為無(wú)活性狀態(tài)的磷酸化GSK-3β的保溫組和低溫組分別降低55％和53％,而GSK-3β總體水平?jīng)]有變化。
　　 實(shí)驗(yàn)三:手術(shù)后接受氯化鈉處理的大鼠,術(shù)后3天測(cè)試工作記憶短暫損害。手術(shù)后接受氯化鋰處理的大鼠,術(shù)后工作記憶與對(duì)照組沒(méi)有明顯差異。手

14、術(shù)創(chuàng)傷使氯化鈉組大鼠術(shù)后3天腦內(nèi)tau蛋白Thr205位點(diǎn)和Ser396位點(diǎn)磷酸化與對(duì)照組比較分別增加了2.7倍和1.2倍,但total tau沒(méi)有顯著變化。給與氯化鋰干預(yù)后tau蛋白與對(duì)照組沒(méi)有明顯變化。高度磷酸化Thr-205和GSK-3β抗體雙染表達(dá)定位于海馬CA1區(qū)。與對(duì)照組比較,術(shù)后第1,3天氯化鈉組IL-1βmRNA分別增加1.5和0.5倍,氯化鋰組增加1.4倍和50％(P<0.01)。術(shù)后1天,氯化鈉組和氯化鋰組IL-3β

15、蛋白表達(dá)分別增加0.9和0.67倍。術(shù)后第1天兩組TNF-αmRNA的表達(dá)均增加0.23倍。TNF-α蛋白表達(dá)沒(méi)有顯著變化。在氯化鈉組,GSK-3β激活,表現(xiàn)為無(wú)活性狀態(tài)的磷酸化GSK-3β降低55％,而GSK-3β總體水平?jīng)]有變化。氯化鋰組磷酸化GSK-3β與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異。
　　 結(jié)論
　　 1、異氟烷麻醉后可以導(dǎo)致持久的低溫,tau蛋白磷酸化并非麻醉本身所致,而是麻醉誘發(fā)的低溫對(duì)磷酸酶活性的抑制,從而引起tau