卵巢癌紫杉醇耐藥與蛋白質(zhì)p-cofilin相關性的研究.pdf

1、研究背景和目的：卵巢癌是婦科惡性腫瘤中發(fā)病率占第三位，死亡率占第一位的惡性疾病。在滿意的腫瘤細胞減滅術的基礎上，輔助紫杉醇+順鉑為主聯(lián)合化療的治療策略雖然明顯改善了初治卵巢癌的預后，但是晚期卵巢癌的5年生存率仍然徘徊在15—20％左右。化療后腫瘤原發(fā)或獲得性對化療藥物耐藥是治療失敗的主要原因之一。目前對腫瘤耐藥機制的認識已經(jīng)相對深入，但是對于臨床的指導意義和應用價值卻十分有限。已知的耐藥相關基因在卵巢癌中的表達不能很好地預測腫瘤的耐藥性

2、和預后，mRNA的豐度與其相應的蛋白質(zhì)水平的表達具有不一致性可能是主要的原因之一。蛋白質(zhì)組學技術為從蛋白質(zhì)表達水平深入研究卵巢癌化療耐藥問題提供了可能性。 2003年，本課題組受北京協(xié)和醫(yī)院重點基金資助，開展了卵巢癌耐藥相關蛋白的比較蛋白質(zhì)組分析，尋找耐藥相關候選蛋白的研究。在通過體外不同給藥方式誘導卵巢癌耐紫杉醇細胞株SKOV3，以及獲購卵巢癌紫杉醇敏感和耐藥細胞株A2780的基礎上，采用雙向電泳技術(2—DE)，成功制備紫杉

3、醇化療敏感和耐藥細胞株的蛋白質(zhì)表達圖譜。應用比較蛋白質(zhì)組學技術尋找差異蛋白的表達，篩選獲得了高豐度的耐藥標記物候選蛋白Cofilin。經(jīng)Western—blot驗證，總Cofilin蛋白在卵巢癌紫杉醇敏感和耐藥的細胞間的表達無明顯差異，而磷酸化Cofilin(p—cofilin)的表達有顯著性差異。經(jīng)過對24例化療敏感患者與22例耐藥患者的卵巢上皮癌組織切片的免疫組化染色，結(jié)果表明，總Cofilin在兩組中的表達無明顯差別；但化療耐藥組

4、中磷酸化Cofilin的表達明顯高于化療敏感組。進一步的功能研究也表明，候選蛋白Cofilin1可能與卵巢癌細胞對紫杉醇耐藥相關。 Cofilin是actin(微絲)結(jié)合蛋白，控制actin的聚合和解聚。磷酸化cofilin是actin的失活形式，去磷酸化是活化形式。磷酸化和去磷酸化的動態(tài)轉(zhuǎn)換是actin行使功能的前提。Actin和紫杉醇的作用靶點tubulin(微管)均是構(gòu)成細胞骨架的主要成分。細胞骨架的功能主要參與細胞形態(tài)的

5、維持，參與細胞內(nèi)的物質(zhì)運輸和細胞的分裂，參與細胞的運動和收縮，參與細胞的信號轉(zhuǎn)導。 本研究在前期工作的基礎上，進一步探討候選蛋白Cofilin的磷酸化過程與紫杉醇作用及耐藥的相關性。通過分析Cofilin在體內(nèi)行使功能與紫杉醇抗腫瘤細胞機制的契合點，探討應用細胞周期同步化的方法使耐藥細胞更多的集中在S期，并同步進入M期，以增強紫杉醇的抗腫瘤效果，改善細胞的耐藥性。 研究內(nèi)容及方法： 1、卵巢癌SKOV3、A278

6、0紫杉醇敏感和耐藥細胞系的細胞形態(tài)和生物學特性比較。通過復蘇培養(yǎng)已成功誘導三年的卵巢癌耐紫杉醇細胞系SKOV3/TJ2500和A2780/TA2780，采用MTT法，觀察其耐藥性的維持。進一步對細胞的形態(tài)、生長曲線、以及生長周期進行檢測。 2、針對卵巢癌耐紫杉醇細胞系體外誘導和培養(yǎng)的特性，采用無血清培養(yǎng)法，將紫杉醇敏感和耐藥的四種細胞系細胞饑餓培養(yǎng)48小時之后，以不同濃度的紫杉醇作用，在不同時間點收集細胞，提取細胞的蛋白質(zhì)，以W

7、estern—blot法檢測，觀察去除血清里外源性因素對p—cofilin影響后，紫杉醇對細胞自身p—cofilin表達的影響。 3、卵巢癌紫杉醇耐藥相關候選蛋白p—cofilin的功能研究。應用真核細胞基因轉(zhuǎn)染技術，將含正義cofilin序列的質(zhì)粒和cofilin磷酸化位點S用D取代構(gòu)建質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染紫杉醇敏感細胞A2780后，Westernblot檢測p—cofilin和總cofilin的表達情況；MTT法檢測耐藥性的改變。

8、 4、紫杉醇敏感及耐藥細胞周期的同步化對紫杉醇殺傷作用影響的研究。將紫杉醇敏感和耐藥細胞用脫氧胸腺嘧啶核苷處理后，分別加入不同濃度梯度紫杉醇，在用藥后不同的時間點收集細胞，用流式細胞儀分析細胞周期的變化。以不經(jīng)同步化處理的細胞為對照，在不同時間點收集細胞，用流式細胞儀檢測細胞凋亡的的情況。 研究結(jié)果： 1、MTT法測定的結(jié)果顯示，紫杉醇敏感細胞系SKOV3和A2780的耐藥指數(shù)為1，SKOV3和A2780耐紫杉醇

9、細胞系TJ2500與TA2780的耐藥指數(shù)分別為62.35±11.3和25±6.5。姬姆薩—瑞氏染色的結(jié)果提示，耐藥細胞TJ2500的多核和畸形核細胞較敏感細胞SKOV3常見。而耐藥細胞TA2780形態(tài)上改變明顯，細胞大部分呈梭形，敏感細胞A2780呈圓形。細胞生長周期的結(jié)果提示兩種耐藥細胞的群體倍增時間均延長。耐藥細胞周期中G0-G1期細胞比率均增加，S期比率減少，差異顯著，M期細胞比率變化不大。 2、采用無血清培養(yǎng)法將紫杉醇

10、敏感和耐藥的細胞饑餓培養(yǎng)48小時后，以不同濃度的紫杉醇作用，在不同的時間點收集細胞，Westernblot檢測的結(jié)果表明，紫杉醇敏感和耐藥的細胞系均有較高水平的內(nèi)源性p—cofilin的表達。在經(jīng)不同濃度的紫杉醇作用后，在一定的時間點，紫杉醇敏感細胞的內(nèi)源性p—cofilin表達出現(xiàn)下調(diào)；隨著藥物濃度的增加，下調(diào)的時間有所延長。而紫杉醇耐藥的細胞經(jīng)過不同濃度的紫杉醇作用后，內(nèi)源性p—cofilin的表達無明顯變化。 3、卵巢癌紫

11、杉醇敏感細胞A2780轉(zhuǎn)染正義cofilin質(zhì)粒后，cofilin及p—cofilin的表達均上調(diào)。MTT檢測的結(jié)果表明，與親本細胞相比，耐藥指數(shù)由1上升至11.5～11.8。A2780轉(zhuǎn)染cofilin磷酸化位點替代S3D質(zhì)粒后，p—cofilin的表達略有下調(diào)。與親本細胞相比，耐藥指數(shù)由1下降為0.1～0.16。 4、低濃度紫杉醇10nmol/l和高濃度100nmol/l用藥24小時對細胞周期G2/M期阻滯的影響在SKOV3

12、、A2780中有顯著性差異。100nmol/l和1000nmol/l之間的差異不顯著。相同濃度紫杉醇隨著作用時間的延長，對G2/M期的阻滯作用增加，以用藥后24小時最顯著。敏感細胞和耐藥細胞經(jīng)細胞周期同步化處理后加入紫杉醇，短時間內(nèi)撤藥，其凋亡率敏感和耐藥細胞均較對照組增高，以48小時檢測結(jié)果差異最顯著。 研究結(jié)論： 1、卵巢癌紫杉醇敏感及耐藥細胞系SKOV3和A2780經(jīng)復蘇培養(yǎng)，與本課題前期研究的細胞相比，生物學特征

13、無明顯的改變。在誘導耐紫杉醇三年后，MTT法測定的結(jié)果顯示，SKOV3和A2780耐紫杉醇細胞系TJ2500與TA2780的耐藥指數(shù)分別為62.35±11.3和25±6.5。耐藥指數(shù)較三年前雖有所下降，但仍良好地維持了其耐紫杉醇的特性。 2、采用無血清培養(yǎng)法將紫杉醇敏感和耐藥的細胞SKOV3/TJ2500與A278/TA2780饑餓培養(yǎng)48小時后，四種細胞均有較高水平的內(nèi)源性p—cofilin表達。在經(jīng)不同濃度的紫杉醇作用后，紫

14、杉醇敏感細胞的內(nèi)源性p—cofilin的表達出現(xiàn)下調(diào)；而耐藥的細胞內(nèi)源性p—cofilin的表達無明顯變化。由于磷酸化cofilin是actin的失活形式，去磷酸化是其活化形式，磷酸化和去磷酸化的動態(tài)轉(zhuǎn)換是actin行使功能的前提。紫杉醇敏感細胞在藥物作用后內(nèi)源性p—cofilin的表達下調(diào)，在細胞總cofilin不變的情況下，意味著更多的cofilin轉(zhuǎn)化成為其活化的形式，驅(qū)動actin行使功能，促進細胞的增殖，有利于化療藥物發(fā)揮抗腫

15、瘤的作用。耐藥的細胞在藥物作用后，始終維持內(nèi)源性p—cofilin的高表達，間接證明了其與卵巢癌細胞對紫杉醇耐藥的相關性。 3、卵巢癌紫杉醇敏感細胞A2780轉(zhuǎn)染正義cofilin質(zhì)粒后，cofilin及p—cofilin的表達均上調(diào)，細胞的耐藥指數(shù)上升至。A2780轉(zhuǎn)染cofilin磷酸化位點替代S3D質(zhì)粒后，p—cofilin的表達略有下調(diào)，耐藥指數(shù)下降。進一步證明了p—cofilin的表達增高與卵巢癌對紫杉醇耐藥相關。

16、 4、在一定濃度范圍內(nèi)，紫杉醇的作用隨藥物濃度的增加而提高，達到一定濃度后，這種遞增效應減弱或消失，說明紫杉醇作用濃度有飽和效應。其G2/M期阻滯作用隨用藥時間的延長而增強，以用藥24小時最顯著。在紫杉醇有效濃度范圍內(nèi)，適當延長藥物的作用時間可能會減少耐藥性的產(chǎn)生或可成為逆轉(zhuǎn)耐藥的方法之一。但耐藥細胞的倍增時間明顯延長，需要更長的時間才能提高紫杉醇的效果。細胞周期同步化方法有可能成為減少紫杉醇用藥時間，加強紫杉醇的作用效果以及逆轉(zhuǎn)耐