胰島素抵抗肥胖大鼠orexin A及其受體1調節(jié)睪丸間質細胞睪酮分泌的分子機制研究.pdf

1、胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)是由于各種原因使胰島素在周圍組織攝取和清除葡萄糖的效率下降，機體代償性的分泌過多的胰島素產生高胰島素血癥，以維持血糖的穩(wěn)定。肥胖可以導致IR的發(fā)生，而IR又是肥胖癥、高血壓病、血脂代謝異常等代謝綜合征的共同危險因素。因此，胰島素抵抗一直是內分泌的研究熱點。胰島素抵抗和肥胖已經(jīng)成為一個世界性的問題，導致內分泌和代謝的改變，包括男性性腺功能減退。性腺功能減退常發(fā)生在肥胖的人，伴有睪酮水

2、平的減低。肥胖常伴有性激素濃度的改變。低濃度的睪酮與腹型肥胖和代謝綜合征有關，同時，患心血管疾病的危險性也增加。美國馬塞諸塞州的一項有關男性的研究中，肥胖病人的游離和總睪酮都低于正常人。腹型肥胖使胰島素和C-肽水平升高，而胰島素和C-肽水平與總睪酮和游離睪酮呈負相關。
　　下丘腦脈沖式分泌促性腺激素釋放激素(GnRH)調節(jié)垂體黃體生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)的釋放。LH調節(jié)睪丸間質細胞睪酮的生物合成，LH的分泌受睪酮和雌激

3、素的負反饋調節(jié)。而FSH主要是與支持細胞上的FSH受體結合調節(jié)生精過程。FSH的分泌受活化素和抑制素的調節(jié)。除了垂體促性腺激素調節(jié)睪酮的生物合成，許多的因子也調節(jié)其分泌和合成，比如增食欲素A(Orexin A)。
　　OrexinA和增食欲素B(Orexin B)是涉及到飲食、能量穩(wěn)態(tài)、睡眠周期、獎賞、動脈血壓和心率、自主神經(jīng)系統(tǒng)和許多內分泌軸調節(jié)的下丘腦神經(jīng)肽。他們通過G蛋白偶聯(lián)受體增食欲素受體1(OX1R)和增食欲素受體2(O

4、X2R)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織發(fā)揮其生物學作用。增食欲素(orexins)在中樞水平調節(jié)GnRH分泌，orexin A和B在類固醇存在的條件下刺激LH的分泌，而在卵巢切除大鼠無類固醇的條件下抑制LH分泌，說明orexins在中樞對LH的調節(jié)有雙向性。除了青春期前期大鼠睪丸幾乎不表達前增食欲素原(PPO) mRNA，從出生到成年后均有PPO mRNA的表達，說明大鼠睪丸表達的PPO mRNA可能是年齡依賴性。成年后大鼠睪丸曲精細管和間質

5、均表達orexinA，但是曲精細管可能是orexinA表達的主要部位。成年大鼠睪丸的免疫學研究發(fā)現(xiàn):orexinA的免疫性在成年大鼠生精細胞減數(shù)分裂的特定時期也有表達，表明orexinA可能參與了大鼠生精周期調節(jié)。成年后大鼠睪丸也表達orexin A的受體OX1R。OX1R mRNA的有存在著發(fā)育階段性。在大鼠的體內研究中，證實了睪丸間質細胞不是OX1R mRNA表達的主要來源，同時，并沒有檢測到OX2R mRNA的表達。除了大鼠睪丸表

6、達OX1R，在人類、羊和雞的睪丸也檢測到OX1R和OX2R的表達。OX1R也在人類睪丸的間質細胞、管周肌樣細胞和支持細胞表達。因此orexins及其受體可能參與到生殖系統(tǒng)功能的調節(jié)。近來的研究證實了:在培養(yǎng)的癌癥細胞中，orexins能誘導細胞的凋亡，降低種植在小鼠身上人類結腸癌細胞的生長，而在正常的結腸上皮細胞，orexins卻沒有這種作用。
　　3β-羥類固醇脫氫酶(3β-HSD)是類固醇代謝的關鍵酶，使孕烯醇酮轉化為孕酮，許

7、多器官都表達3β-HSD，3β-HSD是睪丸間質細胞產生睪酮的組織化學標志。許多生長因子、類固醇和細胞因子通過多種途徑調節(jié)3β-HSD的表達。在人類H295R腎上腺皮質細胞中，orexinA能夠刺激類固醇生成和3β-HSD的表達。在中國倉鼠卵巢細胞(CHO)中，orexinA刺激的OX1R表達和p38裂素原活化蛋白酶(MAPK)的磷酸化。而原代提取的睪丸間質細胞中，orexinA通過何種途徑，是否刺激睪酮分泌還不清楚。
　　本研究

8、通過高脂飲食喂養(yǎng)建立胰島素抵抗肥胖大鼠模型，應用高胰島素-正常葡萄糖鉗夾實驗證實模型的建立，觀察血漿orexinA的變化及OX1R在睪丸組織的表達情況;orexinA對睪丸間質細胞增殖的影響;orexinA及其受體OX1R對睪丸間質細胞3β-HSD表達及睪酮分泌調節(jié)，探討orexinA及其受體OX1R對睪丸間質細胞3β-HSD表達及睪酮分泌調節(jié)的分子機制研究。
　　實驗方法：
　　第一部分、Orexin A及OX1R在高脂飲

9、食誘導的胰島素抵抗肥胖大鼠睪丸組織中的表達研究
　　選擇8周齡SPF級雄性SD大鼠40只，隨機分為2組:正常對照組和高脂飲食組(HF)。對照組予以普通顆粒飼料，高脂組予以高脂飼料。飼養(yǎng)8周后，每組隨機選取5只進行高胰島素-正常葡萄糖鉗夾實驗驗證胰島素抵抗大鼠模型的建立。其余大鼠心臟取血，分別進行血糖、血脂、胰島素、LH、FSH、睪酮和orexinA水平測定。處死大鼠后，留取睪丸組織，應用免疫組化檢測睪丸組織OX1R定位表達，wes

10、tern-blot技術檢測睪丸組織OX1R蛋白表達。
　　第二部分、Orexin A對3β-HSD的表達及睪丸間質細胞增殖的影響
　　原代提取大鼠睪丸間質細胞，用濃度梯度orexin A和OX1R特異性抑制劑(SB334867)進行干預， MTT法檢測細胞增殖，凋亡試劑盒檢測細胞凋亡，實時定量PCR檢測3β-HSD mRNA的表達情況。
　　第三部分、OrexinA及OX1R干預睪丸間質細胞睪酮分泌的分子機制研究

11、>　　原代提取大鼠睪丸間質細胞后，western-blot檢測orexin A對OX1R、ERK、p38、JNK MAPKs和3β-HSD蛋白水平的影響，RT-PCR方法檢測orexin A對OX1RmRNA、OX2R mRNA和3β-HSD mRNA水平的影響，RIA檢測睪酮水平。
　　實驗結果：
　　第一部分、OrexinA及OX1R在高脂飲食誘導的胰島素抵抗肥胖大鼠睪丸組織中的表達研究
　　（一） IR大鼠體重和

12、血漿中血糖、血脂、FSH、LH、睪酮和orexinA水平
　　HF組大鼠體重、血清TG、TC、LDL-C均顯著高于對照組，而HDL-C較對照組無統(tǒng)計學意義;HF組血清FSH、LH、睪酮和orexin A水平均低于對照組。
　　（二）免疫組化和western blot分析各組大鼠睪丸組織OX1R的表達
　　免疫組化結果顯示:大鼠睪丸間質細胞有OX1R免疫陽性表達，HF組睪丸組織中OX1R陽性染色顆粒較對照組明顯減少。We

13、stern-blot結果顯示:HF組大鼠睪丸組織OX1R蛋白表達較對照組明顯減少。
　　第二部分、Orexin A對3β-HSD的表達及睪丸間質細胞增殖的影響
　?。ㄒ唬㎡rexin A對原代睪丸間質細胞增殖和凋亡的影響
　　濃度梯度orexinA可促進間質細胞增殖，加入OX1R特異性抑制劑可抑制這種增殖作用。10-6M和10-8 M orexin A減少間質細胞凋亡，而10-10M orexin A無這樣的作用，OX

14、1R特異性抑制劑可抑制orexin A對睪丸間質細胞凋亡的影響。
　　（二） OrexinA對3β-HSD mRNA水平的影響
　　Orexin A能誘導3β-HSD mRNA水平的增高，OX1R特異性抑制劑可抑制這種作用。
　　第三部分Orexin A及OX1R干預睪丸間質細胞睪酮分泌的分子機制研究
　?。ㄒ唬?Orexin A對原代睪丸間質細胞中OX1R的表達的影響
　　本研究結果顯示，OX1R mRN

15、A在原代睪丸間質細胞中表達，而無OX2RmRNA的表達。Orexin A能劑量依賴性的從基因和蛋白水平刺激其受體OX1R的表達。10-6 M、10-8M和10-10M orexin A均能增加OX1R mRNA水平，10-6MorexinA對其受體的影響最大;10-6M和10-8M orexin A在蛋白水平上上調其受體水平，10-6 M orexin A的影響最大，而10-10M orexin A對其受體刺激影響無統(tǒng)計學意義。

16、　　（二） OrexinA對ERK、p38和JNK MAPKs蛋白水平的影響
　　本研究用蛋白印跡方法測定orexin A對ERK1/2和p38 MAPKs的影響。OrexinA能誘導ERK1/2和p38 MAPK蛋白的磷酸化，而分別用U0126和SB203580預處理后，能阻滯這種作用。但是，orexinA對JNK MAPK的磷酸化水平影響無統(tǒng)計學意義。
　　用10-6M orexin A處理的原代睪丸間質細胞，在5、10

17、和30min均能增加ERK1/2蛋白的磷酸化水平，而在60min未見明顯差異，10min的表達最高。10-6MorexinA在處理間質細胞5、10、20和30min均能刺激p38 MPAK的磷酸化，10min的表達最高。SB334867預處理能夠阻滯10-6 M orexinA對ERK和p38蛋白的影響
　?。ㄈ?Orexin A對3β-HSD和睪酮水平的影響
　　10-6M orexinA能刺激3β-HSD蛋白和基因水平

18、上的mRNA表達增多。同時，培養(yǎng)基中睪酮水平也增加。U0126、SB203580或分別和SB334867聯(lián)合阻滯均能一應程度上抑制orexinA作用。
　　結論：
　　1、胰島素抵抗肥胖大鼠體內血漿orexin A水平降低，其受體OX1R在睪丸間質細胞胞漿中表達，且其表達量在IR大鼠睪丸中降低，提示除了中樞系統(tǒng)外，orexin A可能作為一種循環(huán)激素通過自分泌或者/和旁分泌作用參與能量平衡和睪丸間質細胞功能的調節(jié)。