同型半胱氨酸誘導(dǎo)大鼠Alzheimer樣病變及其機(jī)制的研究.pdf

1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文同型半胱氨酸誘導(dǎo)大鼠Alzheimer樣病變及其機(jī)制的研究姓名：張常娥申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：王建枝20070529華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院2007屆博士畢業(yè)論文214、21天，結(jié)果顯示：tau蛋白在Ser396和Ser199Ser202位點(diǎn)出現(xiàn)過(guò)度磷酸化，并且磷酸化的程度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而加重。然后我們用兩個(gè)不同的Hcy劑量(400gkgday或1600gkgday)對(duì)大鼠注射14天，或同時(shí)輔以

2、葉酸和維生素B12作治療組，用相關(guān)抗體進(jìn)行Westernblotting檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)tau蛋白出現(xiàn)多位點(diǎn)的磷酸化；免疫組化和銀染的結(jié)果與上述一致，葉酸和B12能減輕Hcy的此種效應(yīng)。Hcy的劑量升高到1600gkgday時(shí)，除Thr205和Ser214兩個(gè)位點(diǎn)外，其余位點(diǎn)的磷酸化沒(méi)有進(jìn)一步增加。因此，我們就選擇Hcy400gkgday的量注射大鼠14天，作為機(jī)制探討的模型，來(lái)進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。二、二、HPLC測(cè)定的血液中測(cè)定的血液中

3、Hcy濃度濃度為了證實(shí)大鼠tau蛋白出現(xiàn)的過(guò)度磷酸化是Hcy濃度升高所致，我們采用高壓液相色譜檢測(cè)大鼠血漿中的Hcy的濃度。經(jīng)過(guò)14天的Hcy注射，血漿中的Hcy濃度顯著的升高，當(dāng)增補(bǔ)葉酸和B12后明顯的降低Hcy的濃度。這些結(jié)果表明提高血液中的Hcy能誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)AD樣多位點(diǎn)的磷酸化。三、血漿中三、血漿中Hcy的升高對(duì)的升高對(duì)PP2A和GSK3活性的影響及與活性相關(guān)的修飾活性的影響及與活性相關(guān)的修飾我們用32PATP檢測(cè)了PP2A的活

4、性，發(fā)現(xiàn)注射Hcy后，海馬神經(jīng)元PP2A的活性降低40%。Westernblotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PP2Ac總的表達(dá)水平?jīng)]有變化，PP2Ac的Leu309的甲基化（活性形式）水平顯著降低，而Leu309去甲基化水平（失活形式）顯著提高。我們又檢測(cè)了PP2Ac的磷酸化，發(fā)現(xiàn)PP2AcTyr307位點(diǎn)的磷酸化顯著增加，與PP2AcLeu309位點(diǎn)的去甲基呈正相關(guān)。當(dāng)增補(bǔ)葉酸和B12時(shí)，PP2A的活性可以恢復(fù)至對(duì)照組的85％，并增加Leu309

5、位點(diǎn)的甲基化和降低Tyr307位點(diǎn)磷酸化。這些說(shuō)明Hcy通過(guò)阻斷PP2Ac的甲基化和增加PP2Ac的磷酸化來(lái)抑制PP2A的活性。GSK3是AD中一個(gè)關(guān)鍵的激酶，我們利用32PATP檢測(cè)它的活性，發(fā)現(xiàn)各組間沒(méi)有顯著性差異；Westernblotting顯示，GSK3總的表達(dá)水平和Ser9位點(diǎn)的磷酸化水平無(wú)明顯變化。這就可以排除GSK3參與了Hcy誘導(dǎo)大鼠tau蛋白的過(guò)度磷酸化。我們又檢測(cè)了調(diào)節(jié)PP2Ac甲基化的兩個(gè)酶：甲酯酶（PME）和S