syk基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲性抑制作用的體外研究.pdf

1、目的：腫瘤是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的重大疾病，其中乳腺癌是女性發(fā)病率最高的一種惡性腫瘤，并呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著廣大婦女的身心健康。乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜、多步驟的過(guò)程，與許多基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)密切相關(guān)，包括原癌基因的激活 (如HER2/neu)、抑癌基因的突變和丟失(如p53)等。幾十年來(lái)，對(duì)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的基因改變和功能分析一直是該領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)。蛋白酪氨酸激酶(PTKs)是一組能催化底物蛋白酪氨酸殘基磷酸化的酶蛋

2、白，參與許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在控制細(xì)胞分化、增殖和擴(kuò)散中起重要作用。Syk是一種非受體型蛋白酪氨酸激酶，表達(dá)于正常乳腺腺體和上皮組織，可以促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，Syk是乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中重要的抑制因子，在非侵襲性乳腺癌細(xì)胞表達(dá)降低，而在侵襲性乳腺癌細(xì)胞中則表達(dá)明顯降低或缺失。Syk表達(dá)降低或缺失與正常乳腺組織向惡性發(fā)展有關(guān)，但是，Syk抑制腫瘤細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)的具體機(jī)制尚不清楚。本研究將 syk 基因克隆到真核表達(dá)載體pcDN

3、A3.1D/V5-His-TOPO中，在脂質(zhì)體作用下轉(zhuǎn)染Syk表達(dá)缺失的MDA-MB-231細(xì)胞，檢測(cè)該基因誘導(dǎo)的細(xì)胞功能改變，為進(jìn)一步探討Syk抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法：1 構(gòu)建 syk 基因的真核表達(dá)載體提取人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468總RNA，RT-PCR擴(kuò)增syk編碼序列基因片段，并將其克隆到真核表達(dá)載體 pcDNA3.1D/V5-His-TOPO中。經(jīng)PCR擴(kuò)增、Apa Ⅰ酶切及DNA測(cè)序鑒定

4、，證實(shí)pcDNA3.1D/V5-His-TOPO/syk真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。 2 轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞以脂質(zhì)體介導(dǎo)法將 pcDNA3.1D/V5-His-TOPO/syk 真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Syk缺失的人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，經(jīng)G418篩選，構(gòu)建syk基因穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株MDA-MB-231/syk，通過(guò)Western blot和RT-PCR技術(shù)，驗(yàn)證Syk在轉(zhuǎn)染后的乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。 3 VEGF和MMP

5、-9的表達(dá)分析用流式細(xì)胞術(shù)和半定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)3組細(xì)胞：轉(zhuǎn)染syk cDNA組細(xì)胞(MDA-MB-231/syk)、轉(zhuǎn)染空載體組細(xì)胞 (MDA-MB-231/pcDNA3.1)和未轉(zhuǎn)染組野生型細(xì)胞 (MDA-MB-231)中VEGF和MMP-9的表達(dá)情況。 4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) MTT 法檢測(cè) MDA-MB-231/syk、MDA-MB-231/pcDNA3.1和MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力，繪制生長(zhǎng)曲線。

6、 5 細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測(cè)用體外遷移和侵襲力實(shí)驗(yàn)測(cè)定MDA-MB-231/syk、MDA-MB-231/pcDNA3.1 和 MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力。 結(jié)果：1成功構(gòu)建了pcDNA3.1D/V5-His-TOPO/syk真核表達(dá)載體。 2 MDA-MB-231/syk細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)Syk蛋白。 3 MDA-MB-231/syk細(xì)胞較 MDA-MB-231/pcDNA3.1 和MDA-MB-231