Survivin基因與源發(fā)性肝癌侵襲轉移的相關研究.pdf

1、我國原發(fā)性肝癌病死率居所有惡性腫瘤的第二位，占全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的18.8％。乙型肝炎、肝炎后肝硬化則是我國肝癌發(fā)病率和病死率居高不下的主要原因。雖然手術切除仍是可能獲得治愈的主要方法，但根治性切除術后復發(fā)率仍然相當高，還有更多的肝癌患者因腫瘤轉移而失去根治的機會。這是肝癌患者臨床治療失敗的主要原因，也是提高患者生存率和改善預后的重要障礙。因此探討肝癌發(fā)生發(fā)展和轉移復發(fā)的相關因素及分子機理，尋找肝癌早期診斷、預測轉移的生物標記和干預治

2、療的靶分子，對于這種惡性腫瘤的診斷和治療具有重要的理論指導和臨床應用意義。
　　 Survivin基因由效應蛋白EPR-1(effector cell protease receptor-1)cDNA在人類基因庫雜交篩選分離出來，全長14，700 bp，定位于17q25，編碼產(chǎn)生一個由142個氨基酸組成、相對分子質量為16，500的蛋白質。Survivin的主要生物學功能是抗凋亡，是目前已知作用最強的凋亡抑制蛋白。目前，越來越多

3、的學者發(fā)現(xiàn)Survivin在腫瘤細胞中表達，特別是在高轉移潛能的腫瘤細胞中表達。有學者報道Survivin在轉移的肝癌患者樣本中表達的陽性率顯著高于無轉移患者，Survivin表達可能與原發(fā)性肝癌的肝內轉移、門靜脈癌栓等惡性生物學行為有關，但該方面研究較少，而且具體作用機制如何還不明確。
　　 本課題旨在通過對比和分析不同轉移潛能人肝癌細胞系Survivin表達差異及肝癌組織有和無肝內轉移病例中Survivin表達差異，研究Su

4、rvivin與肝癌侵襲轉移之間的關系；通過構建Survivin表達載體pEGFP-C1/survivin重組質粒，研究Survivin過表達后對肝癌細胞侵襲、轉移惡性表型的影響；通過構建Survivin RNAi真核表達載體pGPU16/GFP/Neo-shRNA，探索下調Survivin基因表達對肝癌侵襲、轉移的治療效果，為肝癌轉移的基因治療提供新的靶點；并初步研究Survivin促進肝癌侵襲轉移的作用機制。
　　 第一部分：

5、Survivin在不同轉移潛能肝癌細胞系及肝癌組織中的表達
　　 本部分實驗目的是研究不同轉移潛能人肝癌細胞系及肝癌組織中Survivin表達情況，分析Survivin表達與肝癌侵襲、轉移之間的關系。應用RT-PCR和WesternBlot方法檢測5種不同轉移潛能人肝癌細胞系SMMC-7721、MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM3和HCCLM6細胞Survivin表達情況。收集35例原發(fā)性肝癌組織標本及相應的癌旁組織

6、，其中包括20例無肝內轉移病例及15例存在肝內轉移的病例，RT-PCR和Western Blot方法檢測Survivin表達情況。RT-PCR結果表明，具有相同遺傳背景的轉移潛能肝癌細胞系隨侵襲轉移潛能升高Survivin表達依次升高(P<0.05)，HCCLM6細胞Survivin表達水平最高，Western Blot結果與RT-PCR結果一致。肝癌組織Survivin mRNA表達均為陽性，而癌旁組織無一例陽性表達。Survivin

7、 mRNA的表達水平在肝內轉移組(1.082±0.213)顯著高于無肝內轉移組(0.799±0.224，P<0.05)。Western Blot的結果與RT-PCR結果一致。肝內轉移組Survivin蛋白表達(0.892±0.198)顯著高于無肝內轉移組(0.342±0.237，P<0.05)。以上結果表明，Survivin在原發(fā)性肝癌中表達，且與侵襲轉移等腫瘤的惡性生物學行為有關，Survivin基因高表達可作為判斷HCC侵襲性和進展

8、的一個潛在重要指標。
　　 第二部分：Survivin過表達對肝癌細胞惡性表型的影響
　　 本部分實驗目的是研究Survivin過表達后對肝癌細胞惡性表型的影響。首先構建Survivin表達質粒pEGFP-C1/survivin，將其轉染低侵襲性無轉移潛能人肝癌細胞SMMC-7721，以pEGFP-C1空質粒轉染做對照，G418篩選獲得穩(wěn)定過表達Survivin細胞株C1和穩(wěn)定轉染空質粒細胞株C2，用Realtime P

9、CR和Western Blot方法檢測Survivin表達，體外MTT、黏附、運動、侵襲實驗觀察Survivin過表達后細胞惡性表型的變化。制備18只SMMC-7721細胞裸鼠肝臟原位接種模型，隨機平均分成pEGFP-C1/survivin質粒組，pEGFP-C1空質粒對照組和PBS組。在肝臟原位接種腫瘤后第2天開始給藥，腹腔注射質粒50μg/只，每周2次，連續(xù)給藥6周后處死，解剖觀察肝癌生長、轉移情況，RT-PCR、Western B

10、lot檢測肝癌組織中Survivin和OPN表達，肺組織切片H.E.染色觀察肺轉移情況。腫瘤轉移相關基因芯片比較C1和C2細胞株基因表達差異。用Realtime PCR驗證有差異表達H-ras基因。并檢測OPN基因、蛋白表達情況。結果表明，pEGFP-C1/survivin質粒經(jīng)測序鑒定構建正確，將其轉染SMMC-7721細胞，Survivin表達水平明顯升高。體外試驗顯示C1細胞黏附、體外運動、侵襲能力明顯高于C2細胞(細胞黏附率65

11、.33％±7.24％vs45.34％±5.52％，運動試驗穿膜細胞數(shù)15.3±2.34 vs5.3±2.53，侵襲試驗透膜細胞數(shù)7.3±1.34 vs4.3±1.25，P均<0.05)，MTT結果顯示C1細胞24h、48h和72h三個時間點檢測的OD值明顯高于C2細胞檢測值(P<0.05)。裸鼠實驗結果顯示，pEGFP-C1/survivin質粒組腫瘤瘤重(2.72g±0.16g)明顯重于pEGFP-C1空質粒對照組(1.79g±0.0

12、8g，P<0.05)和PBS組(1.75g±0.07g，P<0.05)。各組肝癌體積的差異趨勢與瘤重一致，pEGFP-C1/survivin質粒組體積(1062.1mm3±376.0mm3)明顯大于pEGFP-C1空質粒對照組(409.7mm3±380.3mm3，P<0.01)和PBS組(460.8mm3+32.3mm3，P<0.01)。pEGFP-C1/survivin質粒組6只裸鼠中有5只發(fā)生肺轉移，pEGFP-C1空質粒對照組和P

13、BS組均無肺轉移發(fā)生，且pEGFP-C1/survivin質粒組3只發(fā)生肝內播散，而pEGFP-C1空質粒對照組和PBS組裸鼠均無肝內播散。RT-PCR及Western Blot結果顯示pEGFP-C1/survivin質粒組Survivin和OPN表達水平明顯高于pEGFP-C1空質粒對照組和PBS組?；蛐酒容^發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定高表達Survivin后，有16個腫瘤轉移相關基因表達上調(H-ras、CTNNA1、CTNNB1、IL8RB、M

14、MP3、ITGB3等)，2個腫瘤轉移相關基因表達下調(TCF20和TP53)。Realtime PCR和ELISA結果顯示C1細胞H-ras和OPN表達水平明顯高于C2細胞。以上結果表明，Survivin基因表達上調后可促進肝癌細胞SMMC-7721的惡性侵襲轉移表型。Survivin高表達可引起多個腫瘤轉移相關基因表達水平改變，其中包括與肝癌侵襲、轉移密切相關的H-ras和OPN基因。
　　 第三部分：Survivin基因RN

15、Ai體外及體內研究
　　 本部分實驗進一步觀察Survivin對肝癌細胞侵襲轉移能力的影響，通過靶向Survivin RNA干擾抑制Survivin表達，觀察高轉移人肝癌細胞系HCCLM6細胞生長、黏附、侵襲能力以及體內腫瘤生長及轉移行為的改變，探索靶向Survivin基因RNAi對肝癌侵襲、轉移的治療效果。首先設計、合成Survivin siRNA，瞬時轉染HCCLM6細胞，Realtime PCR和Western Blot檢

16、測干擾效果。篩選出干擾效率較高靶點用于合成shRNA，構建pGPU6/GFP/Neo-shRNA干擾質粒。重組質粒瞬時轉染HCCLM6細胞，Realtime PCR和Western Blot驗證干擾效果，篩選出干擾效率較高的shRNA重組質粒進行后續(xù)體內、體外實驗。應用MTT、黏附實驗、細胞運動、侵襲實驗觀察細胞增殖、黏附、運動、侵襲能力的改變。Realtime PCR及ELISA方法檢測瞬時轉染shRNA干擾質粒后細胞H-ras和OP

17、N表達。裸鼠實驗觀察腹腔注射Survivin干擾質粒對肝癌生長、轉移和裸鼠生存期的影響。RT-PCR和Western Blot檢測裸鼠肝癌組織Survivin和OPN表達水平。結果表明，針對Survivin基因設計的siRNA均有一定程度的干擾作用，Reaitime PCR顯示其中siRNA-166、siRNA-358的干擾作用較強，可使靶基因分別下調80％和70％，WesternBlot結果與Realtime PCR結果一致，siRN

18、A-166和siRNA-358可使Survivin蛋白分別下調72％和65％。分別構建siRNA-166和siRNA-358兩種pGPU6/GFP/Neo-shRNA重組質粒，并分別命名為shRNA1和shRNA2，經(jīng)測序鑒定插入位點正確。Realtime PCR檢測兩種重組質粒干擾效果，結果示shRNA1和shRNA2對Survivin mRNA抑制率分別為78％和65％，蛋白抑制率達75％和68％，故選擇shRNA1進行后續(xù)實驗。s

19、hRNA1轉染HCCLM6后，體外增殖能力明顯降低，黏附率明顯低于陰性對照質粒轉染細胞，兩者差異有顯著性(43.28％±0.85％vs55.09％±1.45％，P<0.01)；細胞運動、侵襲能力明顯降低，與陰性對照質粒相比兩者差異有顯著性(侵襲試驗透膜細胞數(shù)10.5±1.29 vs20.5±1.29，P<0.01，運動試驗穿膜細胞數(shù)15.8±0.96 vs23.5±1.29，P<0.01)。Realtime PCR結果顯示細胞瞬時轉染s

20、hRNA1干擾質粒后，細胞H-ras和OPN mRNA表達降低，細胞上清OPN蛋白分泌量明顯減少(P<0.01)。裸鼠實驗表明，shRNA1質粒組腫瘤瘤重(1.43g±0.20g)低于陰性對照質粒組(2.19g±0.37g，P<0.01)和PBS組(2.34g±0.55g，P<0.01)。shRNA1質粒組腫瘤體積(679.22mm3±328.72mm3)小于陰性對照質粒組(1397.03mm3±374.49mm3，P<0.01)和PB

21、S組(1636.50mm3±508.80mm3，P<0.01)。陰性對照質粒組和PBS組6只裸鼠都發(fā)生了肺轉移，而shRNA1質粒組只有2只裸鼠發(fā)生肺轉移。shRNA1質粒組荷瘤裸鼠的生存期為70.7天±1.97天，與陰性對照質粒組(40.8天±2.32天)和PBS組(37.5天±4.28天)相比差異顯著(P<0.01)。RT-PCR及Western Blot結果顯示shRNA1質粒組Survivin和OPN表達水平明顯低于陰性對照質粒

22、組和PBS組。以上結果表明，Survivin基因可通過促進肝癌細胞增殖，增強細胞黏附力、細胞運動、侵襲能力參與原發(fā)性肝癌的生長和轉移，Survivin基因下調后肝癌細胞侵襲潛能下降，裸鼠肝癌生長抑制，轉移能力降低，故認為Survivin是潛在的治療原發(fā)性肝癌侵襲、轉移的靶標。
　　 第四部分：Survivin促進肝癌細胞惡性表型機制的初步研究
　　 第二、三部分研究結果表明，Survivin基因過表達后，OPN和H-ra

23、s基因表達上調；而當干擾Survivin基因表達時，OPN和H-ras基因表達下調。本部分通過研究三者之間的關系，以初步探討Survivin促進肝癌侵襲轉移的作用機制。首先構建Survivin表達質粒pcDNA3.1(-)/survivin和Survivin RNA干擾質粒pGPU6/shRNA，并分別瞬時轉染細胞檢測Survivin表達變化。構建含有OPN基因啟動子的熒光素酶報告質粒pOPNGL3并鑒定。設計并化學合成H-ras si

24、RNA序列，瞬時轉染HCCLM6細胞觀察干擾效果，篩選出干擾效果較好的靶點用于后續(xù)實驗。將pcDNA3.1(-)/survivin和pOPNGL3共轉染SMMC-7721細胞，通過檢測熒光素酶活性反映OPN基因啟動子活性，觀察OPN基因啟動子活性的變化。將pGPU6/shRNA和pOPNGL3共轉染HCCLM6細胞，觀察OPN基因啟動子活性的變化。將H-ras siRNA和pOPNGL3共轉染HCCLM6細胞，檢測OPN基因啟動子活性。

25、將pcDNA3.1(-)/survivin、H-ras siRNA和pOPNGL3共轉染HCCLM6細胞，與共轉染pcDNA3.1(-)/survivin、siRNA-NC、pOPNGL3細胞(對照組1)和共轉染pcDNA3.1(-)、siRNA-NC、pOPNGL3細胞(對照組2)對比，觀察OPN基因啟動子活性差異。結果表明：通過測序鑒定pcDNA3.1(-)/survivin和pGPU6/shRNA重組質粒構建正確。pcDNA3.1

26、(-)/survivin重組質粒瞬時轉染SMMC-7721細胞后，Survivin mRNA表達水平升高，為SMMC-7721細胞2.173倍，高于空質粒轉染細胞(相對SMMC-7721細胞1.035倍)。干擾質粒pGPU6/shRNA瞬時轉染HCCLM6細胞后，Survivin mRNA表達水平明顯低于空質粒轉染細胞，抑制效率達70.5％。測序鑒定OPN基因啟動子的熒光素酶報告質粒pOPNGL3構建正確。4組H-rassiRNA分別瞬

27、時轉染HCCLM6細胞進行Realtime PCR檢測，結果發(fā)現(xiàn)v-H-ras-121、v-H-Fas-282、v-H-ras-305、v-H-ras-489干擾效率分別是51％、75.3％、65.6％、34.5％，故選擇v-H-ras-282進行后續(xù)試驗。Survivin過表達后，SMMC-7721細胞OPN基因啟動子活性升高了187.76％。Survivin基因干擾后，HCCLM6細胞OPN啟動子活性降低了61.3％。H-ras基因

28、干擾后，HCCLM6細胞OPN啟動子活性降低了59.5％。pcDNA3.1(-)/survivin、H-ras siRNA共轉染HCCLM6細胞，三組RLU(相對發(fā)光值)分別是16.31±0.67(×104)、37.69±1.34(×104)和15.86±0.32(×104)，實驗組與對照組1相比，熒光素酶相對活性明顯低于對照組1(P<0.01)，而與對照組2相比，沒有明顯差異(P>0.05)，說明Survivin過表達對OPN啟動子的

29、激活作用，可以被H-ras表達下調所阻斷。以上結果表明，Survivin過表達可以促進OPN基因啟動子活性；H-ras基因可以通過調控OPN啟動子活性，調控OPN基因表達；Survivin促進OPN啟動子活性的作用可以被H-ras RNAi阻斷。故認為Survivin、H-ras和OPN三者之間可能存在密切的聯(lián)系，Survivin可能是通過促進H-ras基因表達激活OPN基因轉錄，進而使其表達上調，發(fā)揮促進肝癌侵襲轉移的作用。
　

30、　 1.Survivin表達和肝癌細胞侵襲轉移能力相關；肝癌組織中Survivin表達與肝內轉移有關。
　　 2.Survivin能促進肝癌細胞系SMMC-7721侵襲轉移惡性表型。Survivin高表達可引起SMMC-7721細胞H-ras、OPN等多個腫瘤轉移相關基因表達改變。
　　 3.RNA干擾下調Survivin表達后，肝癌細胞HCCLM6增殖、黏附、侵襲能力下降，并引起裸鼠體內腫瘤生長抑制及轉移能力下降，故

31、認為Survivin是潛在的治療原發(fā)性肝癌侵襲、轉移的靶標。
　　 4.原發(fā)性肝癌中Survivin高表達可以上調H-ras基因表達水平，而H-ras基因可以通過調控OPN啟動子活性，上調OPN基因表達，Survivin、H-ras和OPN三者可能存在密切的聯(lián)系，并且發(fā)現(xiàn)Survivin促進OPN啟動子活性的作用可以被H-ras基因下調所阻斷。故認為，Survivin促進肝癌侵襲轉移作用的部分機制可能是通過促進H-ras基因表達

32、，激活OPN基因轉錄實現(xiàn)的。
　　 創(chuàng)新點：
　　 1.發(fā)現(xiàn)并證實Survivin參與肝癌侵襲轉移過程，為預測和治療原發(fā)性肝癌轉移復發(fā)提供了新靶標。
　　 2.初步探索靶向Survivin的RNA干擾對肝癌細胞體外生長、侵襲、黏附力的影響及抑制體內成瘤、轉移的治療效果。
　　 3.初步探索了Survivin促進肝癌侵襲轉移的作用機制，提示Survivin、H-ras和OPN三者可能存在密切的聯(lián)系，Surv