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文檔簡介
1、目的:研究血紅素加氧酶-1(heme oxygenase,HO-1)在調(diào)控乳腺癌細胞對阿霉素敏感性中的作用及其相關分子機制。
方法:(1)PI染色結(jié)合細胞流式術測定乳腺癌MDA-MB-453和MDA-MB-231細胞對阿霉素的凋亡反應;(2)利用Western blot檢測乳腺癌MDA-MB-453和MDA-MB-231細胞在阿霉素刺激前后HO-1蛋白的表達水平;(3)采用siRNA介導的RNA干擾技術阻斷阿霉素對HO-1的誘
2、導表達,用細胞流式術檢測其對細胞凋亡的影響;(4)采用細胞自噬檢測試劑盒(ENZO)染色,并分別應用共激聚焦顯微鏡、細胞流式術檢測細胞自噬水平;(5)應用雙熒光素酶基因檢測、Western blot等方法檢測阿霉素刺激STAT3等轉(zhuǎn)錄因子及Src等蛋白激酶的活性變化;(6)應用siRNA干擾、Western blot等技術探討阿霉素誘導HO-1表達及其影響乳腺癌細胞對阿霉素敏感性的分子機制。
結(jié)果:阿霉素(0.2μM)刺激48
3、小時后,MDA-MB-453細胞凋亡率明顯上升(從1.5%到40%),而MDA-MB-231細胞的凋亡率較低(從3.29%到13.7%)。Western blot結(jié)果顯示MDA-MB-231細胞經(jīng)阿霉素刺激后,HO-1蛋白出現(xiàn)了顯著的誘導表達上調(diào),而在MDA-MB-453細胞中并未觀察到此現(xiàn)象。沉默HO-1基因表達后,MDA-MB-231細胞凋亡率顯著上升。進一步研究發(fā)現(xiàn),阿霉素可誘導MDA-MB-231細胞的自噬水平明顯升高,抑制自噬
4、后MDA-MB-231細胞凋亡率明顯上升。抑制HO-1基因表達后,MDA-MB-231細胞的自噬水平顯著下降。阿霉素的刺激作用下,MDA-MB-231細胞出現(xiàn)了STAT3和磷酸化STAT3蛋白表達上調(diào),雙熒光素酶報告基因表達分析顯示STAT3的轉(zhuǎn)錄活性增強,抑制STAT3的表達后HO-1蛋白的誘導表達及細胞自噬水平均顯著被抑制。在MDA-MB-231細胞中,阿霉素還顯著誘導Src活化水平上調(diào),抑制Src的表達后STAT3轉(zhuǎn)錄活性、HO-
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