PFV反式激活因子Bel 1核定位機制的初探.pdf

1、泡沫病毒(foamy viruses，F(xiàn)V)，是一類復雜的逆轉錄病毒，其前病毒兩端具有長末端重復序列(long terminal repeat, LTR)，中間為結構基因gag、pol、env。env與3'LTR之間存在內部啟動子(internal promoter, IP)，啟動下游非結構基因tas，bet等的轉錄。非結構蛋白Tas，在原型泡沫病毒(prototype foamy virus，PFV)中又名Bel1(between e

2、nv and LTR，Bel1)，可反式激活病毒的LTR和IP啟動子，是FV完成生活周期不可或缺的正調控蛋白。
　　PFV Bel1以DNA結合的方式行使反式激活功能，入核是其行使功能的必要條件。目前對其核定位信號(nuclear localization signal，NLS)的研究尚不深入，且存在分歧，對入核機制的研究未見報道。為明確Bel1的核定位信號并探究其入核的分子機制，本文通過建立體外核定位信號篩選方法和體外重組蛋白質

3、入核分析方法，分析了Bel1的NLS序列并對其核定位的分子機制進行了初步探究:
　　1.通過成功構建了GST-EGFP空載體及GST-EGFP-BiNLS質粒，表達純化獲得融合蛋白。以GST-EGFP蛋白為負對照，GST-EGFP-BiNLS為正對照，成功建立體外核定位信號篩選體系:通過觀察融合蛋白能否進入細胞核，可判定融合序列中是否包含NLS;結合進一步的分子生物學實驗，可準確界定組成NLS的關鍵氨基酸。利用上述體外核定位信號篩

4、選體系，通過原核表達純化包含Bel1201-226肽段的融合蛋白，明確了201-226肽段中包含Bel1的NLS;在此基礎上，構建其K218A、K218R、R219A、R221A突變體，確定R219為Bel1 NLS的關鍵氨基酸殘基，而K218為非保守氨基酸。
　　2.本文同時構建了GST-KPNA系列、His-KPNB1、His-RanGTPase原核表達質粒并表達純化獲得相應的融合蛋白，建立了蛋白質入核體外重組分析系統(tǒng)，該方法