奶牛組織器官SLC15家族的表達及二肽對小腸上皮細胞SLC15家族的影響.pdf

1、質子轉運載體15家族（Solute carrier15 family，SLC15）又被稱為小肽轉運載體家族，主要位于細胞膜上，能夠利用電化學梯度將短鏈肽和擬肽類物質轉運進入細胞內。SLC15家族成員主要包括SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4，目前鮮有報道能夠全面地研究這些小肽轉運載體在成年奶牛上的表達差異。小肽轉運載體能夠轉運腸道中的營養(yǎng)物質，它也受這些營養(yǎng)物質調控。丙氨酰谷氨酰胺二肽（alanyl-glut

2、amine，Ala-Gln）作為小腸的主要能源物質，它對腸道中小肽轉運載體的調控也鮮有研究。因此本試驗研究SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4在成年奶牛組織器官中的表達情況以及Ala-Gln對奶牛小腸上皮細胞(Bovine intestinal epithelial cells，BIECs)中小肽轉運載體的調控作用，為SLC15家族在成年奶牛中的生物學功能以及Ala-Gln對BIECs的調控機制提供科學依據。<

3、br>　　試驗一、小肽轉運載體在成年奶牛組織器官中的表達
　　試驗選取3頭健康的成年荷斯坦奶牛進行屠宰，采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、瘤胃、網胃、瓣胃、皺胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸和直腸。試驗采用實時熒光定量PCR法對器官組織中的SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4mRNA進行分析;采用Western Blot方法對器官組織中的SLC15A1、SLC15A2和SLC15A4蛋白進行分析。試驗

4、結果發(fā)現SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4 mRNA在器官組織中均能表達，但是在回腸中沒有發(fā)現SLC15A2 mRNA的表達。SLC15A1在成年奶牛的肺臟、腎臟和空腸的表達極顯著高于其它器官組織(P＜0.01); SLC15A2在腎臟組織中的表達量均極顯著高于其它器官組織(P＜0.01);SLC15A3 mRNA在瘤胃、脾臟、結腸和肺臟中的表達極顯著高于其它器官組織(P＜0.01); SLC15A4在脾臟，

5、腎臟，肝臟，盲腸，結腸和肺臟中均有較高的表達水平。
　　試驗二、奶牛小腸上皮細胞原代培養(yǎng)及其小肽轉運載體的表達
　　在無菌條件下分離奶牛小腸上皮組織，用胰酶消化獲得BIECs并純化，免疫熒光和瓊脂糖凝膠電泳鑒定BIECs，實時熒光定量PCR檢測細胞內SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4 mRNA表達;Western Blot檢測細胞中SLC15A1、SLC15A2和SLC15A4蛋白表達。結果表明，

6、BIECs的細胞質中均含有細胞角蛋白18熒光，在細胞中檢測到絨毛蛋白、上皮細胞鈣粘蛋白和小腸脂肪酸結合蛋白基因的表達證實細胞為純化的BIECs。細胞中SLC15A1 mRNA的表達量極顯著高于SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4 mRNA(P＜0.01)。SLC15A1蛋白的表達量最高，極顯著高于SLC15A2和SLC15A4(P＜0.01)。
　　試驗三、Ala-Gln對奶牛小腸上皮細胞中小肽轉運載體表達的影響

7、　　不同時間和濃度的Ala-Gln培養(yǎng)BIECs，確定最佳培養(yǎng)時間和濃度。用實時熒光定量PCR檢測Ala-Gln、丙氨酸(L-alanine，Ala)和谷氨酰胺(L-glutamine，Gln)對BIECs中小肽轉運載體及其相關基因mRNA的影響，Western Blot檢測Ala-Gln、Ala和Gln對BIECs中SLC15A1、SLC15A2和SLC15A4蛋白的影響。結果發(fā)現，Ala-Gln能夠促進BIECs增殖，其中1 mM

8、Ala-Gln在4h時極顯著促進細胞增殖(P＜0.01)，并且該組中SLC15A1mRNA、SLC15A2 mRNA、SLC15A3mRNA和SLC15A4 mRNA的表達量極顯著高于其它各組(P＜0.01)，顯著促進SLC15A1蛋白的表達(P＜0.05)。Cdx2和PPAR-α mRNA的提高能夠上調SLC15A1mRNA的表達量。Ala-Gln培養(yǎng)BIECs后發(fā)現磷脂酰肌醇3激酶(pho sphatidylinositol3-ki

9、nase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信號通路關鍵基因的表達都顯著升高（P＜0.05）。
　　綜上，SLC15A1、SLC15A2、SLC15A3和SLC15A4在成年奶牛中廣泛表達，但是它們在器官組織中的表達水平存在較大差異。SLC15A1 mRNA在BIECs中表達量最高，主要是通過Cdx2和PPAR-α基因調控的。Ala-Gln能夠上調小肽轉運載體的表達，并且能上調PI3K/AKT傳導信