成年哺乳動物小腸Cajal間質細胞可塑性調控機制的實驗研究.pdf

1、Cajal細胞(InterstitialcellsofCajal，ICCs)作為一種特殊的間質細胞，以細胞網絡的形式分布于整個胃腸道。近二十余年，國內外學者通過對胃腸壁內ICCs的形態(tài)特征、超微結構、起源及生理功能等一系列研究表明：ICCs具有產生自發(fā)性電慢波、參與神經信息整合與傳遞等功能，對胃腸平滑肌運動具有重要調節(jié)作用。 近年的臨床研究發(fā)現ICCs數量減少與一些胃腸運動功能障礙性疾?。豪缣悄虿∥篙p癱、慢傳輸型便秘、Croh

2、n’s病、術后胃腸運動功能障礙等密切相關。盡管上述疾病的發(fā)生機制尚不清楚，但均有一個共同的病理變化：即病變部位胃腸壁內ICCs數量呈不同程度減少，甚至缺如，ICCs彼此間及其與平滑肌細胞間不能形成完整的細胞網絡。但因對上述疾病的發(fā)病機理及ICCs減少、細胞網絡完整性被破壞的原因等尚不清楚，一直是臨床治療的難題。設想如果能夠闡明促進ICCs細胞網絡完整性恢復的調控機制，勢必為臨床相關疾病的治療提供有益的思路。 ICCs表達c-ki

3、t基因產物，一種原癌基因編碼的受體酪氨酸激酶(Kit)。它的配體是干細胞因子(stemcellfactor，SCF)，由平滑肌和神經產生。在Kit或SCF基因突變的小鼠和大鼠，以及用Kit中和性抗體或Kit受體阻斷劑在胚胎晚期或生后早期阻斷Kit受體功能，將引起ICCs數量明顯減少或丟失，伴有胃腸運動功能障礙，表明胚胎期ICCs的發(fā)育、存活及形態(tài)的維持需要Kit/SCF信號通路功能的正常。 體外研究亦發(fā)現，在外源性SCF的作用下

4、，培養(yǎng)的小鼠小腸ICCs具有一定的增殖能力，但這種增殖僅見于生后6天前的新生鼠，提示ICCs的增殖具有時間依賴性和SCF依賴性。我們的研究發(fā)現，小腸半橫斷吻合術后，吻合部位丟失的ICCs隨時間的經過能夠逐漸恢復正常的數量和分布模式，提示成年動物ICCs仍具有一定的增殖能力，且與平滑肌表達SCF有關，提示Kit/SCF信號通路可能參與了這一過程。 已知成年哺乳動物胃腸壁內ICCs持續(xù)表達c-kit及其產物KIT蛋白，KIT/SCF

5、信號通路對發(fā)育成熟的ICCs是否具有與胚胎期相似的作用尚不清楚。抑制成年哺乳動物Kit信號通路后，ICCs是否減少?發(fā)生凋亡或者轉分化?丟失后能否恢復正常分布?在此過程中Kit/SCF信號通路的作用如何均亟待闡明。此外，腸梗阻等胃腸運動功能障礙性疾病ICCs丟失后能否恢復正常分布以及Kit/SCF信號通路的是否參與這一過程的調節(jié)均不清楚。因此，探討Kit/SCF信號通路對成熟ICCs可塑性的調控機制將有利于理解胃腸運動功能障礙性疾病的發(fā)

6、病機制，同時為臨床相關疾病的治療開辟新的策略。 本實驗分為兩個部分： 第一部分：Imatinib是Kit受體的特異性抑制劑。本研究給成年小鼠和豚鼠連續(xù)口服Imatinib，利用Kit和Vimentin免疫熒光染色觀察阻斷Kit信號通路后，ICCs的數量和突起長度的變化，同時Kit/a-SMA雙重免疫熒光標記觀察ICCs是否向平滑肌表型轉分化，以及體外灌流觀察小腸功能變化；停Imatinib處理后觀察ICCs恢復情況以及小

7、腸功能變化，并用Kit/PCNA和Kit/BrdU雙重染色對各實驗組ICCs的增殖進行分析。 主要結果如下： 1、Imatinib處理后，成年豚鼠和小鼠小腸的ICCs數量逐漸減少，隨時間的延長尤為明顯，最多可減少1/2以上，同時自主節(jié)律性運動功能亦受到抑制。 2、ICCs數量減少的同時，可見Kit/a-SMA雙標陽性ICC和Kit(-)/a-SMA(+)ICC樣細胞，提示ICCs可能向平滑肌的表型轉分化，但未見I

8、CC出現凋亡。 3、停止Imatinib處理后，ICCs數量和功能逐漸恢復正常，與此同時可見大量的BrdU/Kit和PCNA/Kit雙標陽性的細胞。 上述結果表明成年哺乳動物ICCs具有較強的可塑性，Kit信號通路對成熟ICCs的存活和增殖具有重要的調控作用，該信號通路功能障礙可能導致ICCs的發(fā)生轉分化，成熟ICCs具有較強的增殖能力。 第二部分：制作小腸機械性腸梗阻模型，采用Kit及Kit/a-sMA單/雙重

9、免疫熒光染色觀察梗阻期間和解除梗阻后ICCs的數量變化，WesternBlot檢測SCF和Kit磷酸化(p-Kit)的變化，用Kit/BrdU雙重染色顯示成熟ICCs的增殖以及體外灌流檢測小腸運動功能變化，探討ICCs的數量變化與SCF表達及Kit信號通路激活或抑制的相關性。 主要結果如下： 1、梗阻期ICCs數量逐漸減少，梗阻14天靠近梗阻部位最明顯，并可見Kit/a-SMA雙標陽性細胞，同時腸運動功能亦受到明顯的抑制

10、； 2、在梗阻期SCF表達量和p-Kit均下降，靠近吻合口部位最明顯，約為正常的1/2到1/3，解除梗阻后，SCF和p-Kit恢復正常。 3、解除梗阻后，ICCs數量增加，逐漸恢復正常分布模式同時可見大量BrdU/Kit雙標陽性細胞，與此同時小腸運動功能也恢復正常。 上述結果表明SCF表達的變化與Kit信號通路的抑制和激活密切相關，同時Kit信號通路對成熟ICCs的存活、表型維持以及增殖等可塑性具有重要調節(jié)作用。

11、 綜上所述，本研究初步證明了成熟ICCs具有較強的可塑性，這種可塑性與Kit/SCF信號通路密切相關；Kit活性被抑制后ICCs可能向平滑肌的表型轉分化；解除抑制后，ICCs能夠恢復正常的數量和分布模式，其數量的增加與ICCs的增殖有關；腸梗阻時，ICCs數量的減少和解除梗阻后數量的增加與平滑肌表達SCF的變化平行，提示胃腸運動功能障礙性疾病可能與平滑肌表達的SCF不足，Kit信號通路活性低下有關。靶向性提高SCF的表達或直接激