不同補片對體外培養(yǎng)人胎肺成纖維細胞增殖和膠原蛋白合成功能的影響.pdf

1、腹外疝是臨床上的常見病和多發(fā)病，隨著外科材料學的發(fā)展，無張力疝修補術日益增多，現(xiàn)已成為外科臨床的常規(guī)技術，補片質量也成為影響手術復發(fā)率及并發(fā)癥發(fā)生率的重要因素之一。 就補片品質而言，其主要影響因素有兩個方面，1：補片的生物相容性，2：補片對體內成纖維細胞膠原合成的影響。對于前者，補片的生產廠家都已做了大量詳實的相關研究，有許多資料可供參考，而后者我們可以獲得的資料甚少。為此，本研究就臨床上最常用的三種不材質的補片，進行體外實驗研

2、究，希望能獲得相關數(shù)據(jù)，以期為疝外科臨床提供有益的幫助。 研究目的： 1、觀察不同材質的補片在體外同一條件下對人成纖維細胞的增殖、凋亡的影響。 2、觀察不同材質的補片在體外同一條件下對人成纖維細胞膠原合成的影響。 實驗方法： 1、實驗分組 本研究分4組及正常對照組、聚丙烯組(PP組)、聚酯組(PE組)和膨化聚四氟乙烯組(ePTFE組)。正常對照組為在培養(yǎng)的成纖維細胞中不加入補片，三個實驗組

3、分別加入聚丙烯補片(PP組)、膨化聚四氟乙烯補片(ePTFE組)和聚酯補片(PE組)。其他培養(yǎng)條件完全相同。 2、觀察指標及方法 2.1人成纖維細胞(HFL1)的培養(yǎng)和傳代 按照American Type Culture Collection(ATCC)要求，用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基(包含青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL)于37℃在含5％CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每2-3天傳代，取第四代增殖狀態(tài)良

4、好的細胞實驗。 2.2細胞增殖實驗(MTT法) 將貼壁培養(yǎng)的人成纖維細胞消化分離計數(shù)，用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液稀釋到1×105/ml，接種于24孔板，每孔0.5ml，依次用含10％和1％的FBS的DMEM培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24和12小時，最終改用無血清DMEM培養(yǎng)基進行實驗，并分別加入大小為1.0cm×1.0cm的三種補片，在補片上壓以長1.0cm，直徑2mm的鈦絲以防止補片浮起，繼續(xù)培養(yǎng)48小時直接加入100ulM

5、TT試劑，37℃孵育4小時，吸出800ul培養(yǎng)基，每孔加入500ul二甲基亞砜，于室溫下震蕩15分鐘，使結晶物充分溶解。用酶標儀在492nm處測量各孔的吸光度。細胞增殖情況用各孔的吸光度表示。 2.3細胞周期測定(流式細胞術法)： 以S期細胞指數(shù)(SPF)及凋亡細胞比例觀察各補片對細胞周期的影響。 首先將人成纖維細胞消化分離計數(shù)，用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液稀釋到1×105/ml，接種子12孔板，每孔1ml，

6、依次用含10％和1％的FBS的DMEM培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24和12小時，然后改用無血清DMEM培養(yǎng)基，并分別加入大小為1.5cm×1.5cm的三種補片，在補片上壓以長1.5cm直徑2mm的鈦絲以防止補片浮起，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，以0.05％胰酶消化細胞、血清中和后收集細胞，1000轉/分離心5分鐘，并用PBS洗滌離心三次，最后一次離心后棄去大部分PBS，僅保留約0.5ml，加入70％冷乙醇2ml固定，4℃過夜后，離心棄去乙醇，PBS洗滌，10

7、00rpm離心10分鐘，RNase A(0.5mg/ml)37℃消化30分鐘，PI(50mg/ml)染色，室溫避光30分鐘，上機檢測，設定激發(fā)光波長為488nm．細胞增殖情況由S期細胞指數(shù)(SPF)表示，S期指數(shù)(SPF)=S/(G0/G1+S+G2/M)×100％．細胞凋亡情況由凋亡細胞百分比表示，為凋亡細胞的數(shù)量/總的計數(shù)細胞的數(shù)量。 2.4人成纖維細胞膠原合成功能的檢測(羥脯氨酸測定法)：膠原蛋白總量以羥脯氨酸濃度表示，檢

8、測采用消化法，嚴格按照羥脯氨酸測定試劑盒的要求進行操作，其過程簡述如下。將人成纖維細胞消化分離計數(shù)，用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液稀釋到1x105/ml，接種于12孔板，每孔1ml，依次用含10％和1％的FBS的DMEM培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24和12小時，然后改用無血清DMEM培養(yǎng)基，并分別加入大小為1.5cmx1.5cm的三種補片，在補片上壓以長1.5cm直徑2mm的鈦絲防止補片浮起。繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)48小時。吸去上清，PBS洗滌，胰

9、酶充分消化、中和、吹打，收集細胞，并使用PBS洗滌各孔三次，收集洗滌液，將上述液體，于3000轉/分離心15分鐘，棄上清，并加入純水1000ul，初步破碎細胞，然后用超聲細胞破碎儀充分破碎，上述破碎后的液體，于3500轉離心10分鐘，吸取上清0.5ml，以純水為空白管、2ug/ml的羥脯氨酸標準應用液為標準管，用751紫外分光光度計于550nm測定各管吸光度，并算出羥脯氨酸濃度。計算公式，羥脯氨酸濃度=((測定管吸光度—空白管吸光度)/

10、(標準管吸光度—空白管吸光度))×2.0。 3、統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0軟件，就上述觀察指標進行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，統(tǒng)計方法使用成組設計的方差分析(One—Way ANOVA)，組間比較，方差齊性檢驗，方差齊則使用S—N—K法，方差不齊時使用Dennett's T3法。所有的顯著性水平(P值)均為0.05。 結果： 1、細胞增殖實驗(MTT法)：正常對照組較三個補片組的吸光度為高，差異

11、存在顯著性(P<0.05)。表明三種補片對成纖維細胞增殖均有影響，PP組較PE組為高，差異有顯著性(P<0.05)，ePTFE組與PE組、PP組之間差異無顯著性(P>0.05)。 2、人成纖維細胞S期指數(shù)(SPF)：組間兩兩比較PE組、ePTFE組較PP組、正常對照組S期細胞指數(shù)為高，其差異存在顯著性(P<0.05)。PE組和ePTFE組之間差異并無顯著性(P=0.053)，聚丙烯補片組、正常對照組之間差異也無顯著性(P＝0.2

12、7)。 3、凋亡細胞比例：經統(tǒng)計分析，本研究的細胞凋亡數(shù)據(jù)組間方差不齊，故組間比較使用Dennett's T3法，PE、ePTFE組較PP片組、正常對照組的凋亡細胞比例為高，其差異存在顯著性(P<0.05)。PE組和ePTFE組之間差異無顯著性(P>0.05)，PP組、正常對照組之間差異無顯著性(P>0.05)。 4、細胞膠原蛋白合成水平：正常對照組羥脯氨酸濃度最高，為1.70±0.15；其次為PP組，為1.61±0.1

13、8；PE組再次，ePTFE組最低。但是，正常對照組和PP組之間差異無顯著性(P=0.184)；正常對照組較PE組及ePTFE組高，差異有顯著性(P<0.05)；PE組和ePTFE組之間差異無顯著性(P>0.05)。 結論： 本研究發(fā)現(xiàn)： 1：三種不同材質的補片對體外培養(yǎng)條件下的人成纖維細胞的增殖均有一定的影響。 2：單股編制的聚丙烯網(wǎng)片，對體外培養(yǎng)的人成纖維細胞無論是增殖、凋亡成還是膠原蛋白合的影響均較小