鼠疫耶爾森氏菌在小鼠巨噬細胞上的受體——Murine SIGN-R1.pdf

1、目的：鼠疫耶爾森氏菌是一類引起人與動物鼠疫的革蘭氏陰性菌，其自然宿主是嚙齒類動物。它能夠利用抗原呈遞細胞(抗原presentingcells，APCs)的捕獲，轉移到淋巴結，引起淋巴結鼠疫。但是APCs最初如何捕捉鼠疫菌仍然未知。由于近來發(fā)現(xiàn)的C型凝集素受體與某些革蘭氏陰性菌的核心脂多糖(核心LPS)有作用。因此，我們推測鼠疫菌也是通過某種C型凝集素進入到APCs的，例如巨噬細胞。本次實驗將對這個機制加以驗證，并找到相應的配體和受體。

2、 方法：1通過轉染，建立穩(wěn)定表達小鼠C型凝集素受體的細胞株。含有5種C型凝集素受體cDNA保存在表達載體pcDNA3.1中，轉染至CHO細胞株，得到CHO-mDC-SIGN、CHO-mSIGN-R1、CHO-mSIGN-R3、CHO-mDEC-205(CD205)和CHO-mLangerin(CD207)轉染株，經(jīng)過長時間G418篩選，找到能穩(wěn)定表達的單克隆株，并用流式細胞儀檢測。 2構建鼠疫菌的光滑型和深度粗糙型。野生鼠

3、疫菌是粗糙型，核心脂多糖暴露在最外面。用自殺質(zhì)粒同源重組的方法缺失編碼核心脂多糖起始位的糖基轉移酶，將阻斷核心脂多糖的表達，得到鼠疫菌深度粗糙型。在核心脂多糖外側表達O-抗原將得到光滑型。 3.粘附和侵襲實驗細胞懸浮于含2％FBS的RPMI，以4×105/ml鋪在96或24孔平板中。按照1:50體積加入濃度為1×107CFU/ml的細菌。在37℃，5％CO2下孵育2.5小時。細胞經(jīng)過洗滌后用0.5％的saponin裂解，將裂解液

4、稀釋后涂在平板上，得到粘附和侵襲細菌的總量。 用慶大霉素處理細菌和細胞混合液，能夠殺死細胞外的細菌而不透過宿主細胞膜，得到的是侵入細菌的數(shù)量。100ug/ml的慶大霉素作用1小時后洗去抗生素，裂解細胞進行涂菌計數(shù)。細菌侵襲的程度以細胞裂解液中細菌的CFU來估算。所有的實驗重復3次。 4 流式細胞儀檢測細菌的侵襲能力。細菌在熒光試劑CFDA-SE中染色，洗去多余的染色液后，把標定好的細菌加入到細胞中培養(yǎng)2小時。細胞液經(jīng)過洗

5、滌除去未結合的細菌后，用2％的多聚甲醛固定。在做流式細胞儀檢測前，以1:10加入Trypan blue(0.4％)混勻，室溫10分鐘以淬滅細胞外細菌的熒光。Trypan blue能阻止熒光但不能透過細胞膜。被攝取細菌的比例以細胞發(fā)出的熒光強度來判定，強度越高，細菌被吞噬的程度越高。 5 外源物質(zhì)抑制實驗加入外源物質(zhì)包括抗體，甘露糖，低聚糖，肽等來封阻細胞的吞噬作用，驗證細菌和細胞相互作用的特異性。 6 體內(nèi)吞噬實驗向活體