水稻Rho GTP酶激活蛋白基因OsRhoGAP2及其啟動子在分子育種上的應(yīng)用潛力評估.pdf

1、水稻不僅是主要的糧食作物，同時也是重要的模式植物，對水稻相關(guān)農(nóng)藝性狀功能基因的鑒定意義重大。本實驗室前期對水稻育性控制相關(guān)信號通路開展研究，通過酵母雙雜交篩選，從水稻雌雄蕊形成期幼穗cDNA文庫中分離到若干與Rho蛋白OsRacD相互作用蛋白的編碼基因，其中包括一種Rho GTP酶激活蛋白基因，命名為OsRhoGAP2（GenBank登錄號:AY364311）。本研究對該基因及其啟動子開展系統(tǒng)的功能鑒定和元件分析，以此評估該基因在分子設(shè)

2、計育種上的應(yīng)用潛力。
　　基于本實驗室前期構(gòu)建的該基因啟動子及5個5'端缺失片段載體，分別轉(zhuǎn)化篩選擬南芥，每個轉(zhuǎn)基因擬南芥均獲得3個以上的純合株系。通過GUS組織化學(xué)染色、酶活力測定結(jié)合缺失實驗分析，研究不同啟動子片段驅(qū)動GUS報告基因在生長發(fā)育不同階段、不同組織中的表達，發(fā)現(xiàn)在OsRhoGAP2啟動子5'端的-703bp～-289bp區(qū)域內(nèi)可能著存在1個重要的花藥特異性元件，驅(qū)動了GUS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥的花藥中表達，尤其是在小

3、孢子發(fā)育的初期，而在成熟期時，擬南芥的營養(yǎng)器官（根、莖、葉）以及繁殖器官（果莢）中均沒有表達，由此推測，OsRhoGAP2基因可能在小孢予發(fā)育初期表達，對維持花藥正常發(fā)育有重要作用。通過5種激素(IAA、6-BA、GA、SA、MeJA)、5種脅迫處理（高溫、低溫、干旱、高鹽、黑暗）對生長到10d的轉(zhuǎn)基因擬南芥進行噴施處理，結(jié)合GUS染色，研究不同啟動子片段對激素、非生物脅迫的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)該基因啟動子可能是1個與IAA誘導(dǎo)相關(guān)及脅迫誘導(dǎo)相關(guān)

4、的啟動子，在IAA及高溫、干旱、高鹽誘導(dǎo)條件下能驅(qū)動下游基因表達，而對其他激素沒有響應(yīng)。進一步推測，OsRhoGAP2基因可能參與到了IAA誘導(dǎo)相關(guān)及逆境脅迫誘導(dǎo)相關(guān)的應(yīng)答過程。結(jié)合5'端的缺失實驗表明，在該基因啟動子的-1292 bp～-948 bp存在1個重要的MeJA響應(yīng)元件，推測該基因可能參與了MeJA信號通路。
　　基于本實驗室前期工作，本研究對OsRhoGAP2過表達轉(zhuǎn)基因水稻T2代進行了分子檢測和表型分析，旨在了解該

5、基因在生產(chǎn)上的應(yīng)用潛力。通過提取轉(zhuǎn)基因水稻基因組DNA結(jié)合PCR擴增，對T2代轉(zhuǎn)基因水稻進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)90％以上都是陽性植株;通過qRT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)在T2代轉(zhuǎn)基因水稻中，OsRhoGAP2基因表達量均在14倍以上，其中最高的達到了229倍;對T2代轉(zhuǎn)基因水稻農(nóng)藝學(xué)性狀進行統(tǒng)計分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，其有效分蘗數(shù)有了顯著提高，提高了32.35％-38.75％。提示在分子設(shè)計育種中，可以通過提高OsRhoGAP2基因的表達水