AGEs-RAGE對(duì)糖尿病大鼠聽力損害的影響.pdf

1、前言： 糖尿病是一種多病因引起以慢性高血糖為主要特征的內(nèi)分泌代謝疾病，同時(shí)伴脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。糖尿病為慢性終身性疾病，可累及多種臟器。隨著對(duì)糖尿病并發(fā)癥研究的深入，糖尿病聽力損害日益引起人們的重視，但是糖尿病聽力損害起病隱匿，易與老年性耳聾混淆，待發(fā)現(xiàn)時(shí)常已成為不可逆病變，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。糖尿病與聽力損害的關(guān)系由Jordao于1950年首次報(bào)道，自此引起人們的關(guān)注。Cullen等將糖尿病組與正常組比較，發(fā)現(xiàn)前者聽力損

2、害更明顯，但目前對(duì)其病因及發(fā)病機(jī)制尚未達(dá)成共識(shí)。糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制包括：糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)途徑、多元醇途徑、蛋白激酶C(PKC)激活途徑、己糖胺途徑和氧化應(yīng)激等。高糖情況下，以上機(jī)制共同作用，引起一系列病理變化。其中AGES途徑仍為研究重點(diǎn)。AGEs發(fā)揮作用的一個(gè)重要途徑便是通過與內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞膜上的特異受體--糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor of AGE，RAGE)結(jié)合，引起細(xì)胞因子、激素、氧自由基等可溶性物質(zhì)含

3、量的改變，導(dǎo)致多種蛋白基因表達(dá)水平的改變，參與細(xì)胞凋亡過程，引發(fā)一系列代謝紊亂，這可能是導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的關(guān)鍵途徑。 目的： 本實(shí)驗(yàn)通過建立糖尿病大鼠模型，測(cè)定其腦干聽覺誘發(fā)電位觀察聽力變化，采用免疫組織化學(xué)及RT-PCR等方法測(cè)定耳蝸RAGE水平，同時(shí)測(cè)定血漿中AGEs等指標(biāo)，旨在從蛋白質(zhì)和基因水平上探討旨在探討AGEs及RAGE在糖尿病聽力損害發(fā)生中的作用。 材料與方法： 健康雄性Wistar大鼠30

4、只，體重180～220g，實(shí)驗(yàn)前所有的動(dòng)物測(cè)量腦干聽覺誘發(fā)電位，之后隨機(jī)選出15只作為正常對(duì)照組(NC組)，另外15只以高脂飼料飼養(yǎng)8周后，采用鏈服佐菌素(streptozotocin，STZ)溶液腹腔一次性注射建立2型糖尿病模型(成模12只，DM組)。所有大鼠飼養(yǎng)16周后測(cè)量腦干聽覺誘發(fā)電位后處死，采血測(cè)定空腹血糖、糖化血紅蛋白、血脂、終末糖基化產(chǎn)物等指標(biāo)，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察RAGE在耳蝸組織中的表達(dá)情況：半定量RT-PCR方法

5、檢測(cè)大鼠耳蝸組織RAGE基因表達(dá)情況。 結(jié)果 一.一般觀察結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)過程中，DM組大鼠呈現(xiàn)明顯多尿、多飲、多食及消瘦，皮毛無光澤，生長(zhǎng)緩慢；NC組大鼠無糖尿病表現(xiàn)，生長(zhǎng)及營(yíng)養(yǎng)狀況良好各組大鼠體重變化見表1，由表1可見，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)兩組大鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，DM組比NC組體重明顯下降(P<0.01)。 二.大鼠FPG，HbAlc和血清AGEs情況： 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，DM組和NC組相比，F(xiàn)

6、PG差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；HbAlc差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；血清AGEs差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表2)。 三．兩組大鼠ABR改變兩組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開始前的ABR檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)無明顯差異；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)DM組大鼠ABR各波潛伏期、I～I(xiàn)II波間期明顯延長(zhǎng)，反應(yīng)閾值明顯增高，與NC組比較差異有顯著性，并與FBG、GHbAlc、LDL-c、AGEs和RAGE水平呈正相關(guān)(P<0.01)(見表3、4)。 四

7、.耳蝸病理和免疫組織化學(xué)觀察： 1.耳蝸切片HE染色結(jié)果正常對(duì)照組(NC組)耳蝸組織血管紋清晰，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞亦正常(見圖1)；糖尿病大鼠組(DM組)耳蝸組織中可見血管紋中毛細(xì)血管管徑變細(xì)、管腔狹窄，同時(shí)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量較正常有所減少(見圖2)。 2.耳蝸切片RAGE染色結(jié)果12例糖尿病大鼠組耳蝸組織中8例(66.7％)RAGE蛋白表達(dá)陽(yáng)性，其反應(yīng)主要出現(xiàn)在血管紋細(xì)胞的胞漿和胞核，以胞漿為主，呈現(xiàn)棕黃色顆粒或團(tuán)塊(見圖

8、3、4)，且部分螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和Corte器也同時(shí)發(fā)現(xiàn)有RAGE蛋白表達(dá)(見圖5、6)；正常對(duì)照組耳蝸組織中僅1例(8.3％)表達(dá)弱陽(yáng)性，DM組與NC組相比，耳蝸組織中RAGE蛋白表達(dá)率顯著增加(確切概率法P<0.01)。 五.RT-PCR結(jié)果： 以GAPDH為內(nèi)參照，糖尿病大鼠組耳蝸組織中RAGE mRNA表達(dá)水平為0.94±0.21，正常對(duì)照組為0.61±0.17，兩組間RAGE mRNA表達(dá)水平差異有顯著性(P<0

9、.05)。DM大鼠耳蝸組織基因表達(dá)檢測(cè)中RAGE mRNA表達(dá)水平較NC組明顯升高(見圖9)。 結(jié)論： 通過建立2型糖尿病大鼠模型，探討了微血管改變和AGEs/RAGE在聽力損害的作用，結(jié)論如下： 1.糖尿病大鼠存在聽力損害，ABR可以作為聽力下降早期診斷的客觀評(píng)價(jià)指標(biāo)。 2.聽力損害與血FBG、HbAlc、LDL-c、AGEs和RAGE水平呈正相關(guān)，糖尿病大鼠聽力損害可能與這些因素有關(guān)。 3.糖