Caveolin-1特異性siRNA對乳腺上皮細胞雌激素受體α信號轉(zhuǎn)導通路的影響.pdf

1、乳腺癌是一種常見的婦科腫瘤，近20年來在我國的發(fā)病率逐漸升高，已嚴重威脅女性的健康。乳腺癌的發(fā)生是一個多階段、多因素參與的過程。許多證據(jù)表明，雌激素刺激是乳腺癌發(fā)生的一個重要的致病因子。雌激素的活性主要是受雌激素受體(ER)的調(diào)節(jié)，雌激素受體是核受體家族的成員，并且作為配體激活型轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)雌激素應答基因的表達水平。ERα有三種亞型：ERα-66，ERα-46和ERα-36。核內(nèi)的ERα-66的活化可以較大程度的影響17β-雌二醇(E2

2、)誘導的雌激素依賴性乳腺細胞的增殖。在正常乳腺上皮細胞中，ERα-66處于一個較低的表達水平，但是在向乳腺癌轉(zhuǎn)化的過程中，其表達水平發(fā)生明顯的上調(diào)。然而，在這一過程中，促使ERα-66表達發(fā)生明顯升高的分子機制尚不清楚。此外，另有研究表明ERα-66和ERα-46可以影響NO的合成。ERα-36是一種新型的ERα亞型，它作為一種膜受體，可以影響雌激素和抗雌激素引起的細胞增殖。ERα-36調(diào)節(jié)膜起始的雌激素和抗雌激素信號轉(zhuǎn)導的分子機制已成

3、為近年來關注的熱點。 Caveolae是細胞質(zhì)膜內(nèi)陷形成的凹陷小窩，其標志性蛋白——Caveolin-1(Cav-1)常作為腫瘤抑制因子行使多種細胞功能。值得關注的是，在ERα陽性乳腺癌中，常伴有Cav-1的顯性缺失突變。并有臨床研究表明，在Cav-1缺失的乳腺上皮細胞中，ERα的表達發(fā)生明顯上調(diào)?？梢?，Cav-1與ERα表達水平有著密切的關系。另有證據(jù)表明，在質(zhì)膜上也存在ERα-66的表達，并且其就定位在Caveolae上。在

4、乳腺癌(MCF-7)細胞中，Cav-1過表達可促使胞質(zhì)中的ER轉(zhuǎn)位到質(zhì)膜上。另外，早期研究表明，E2可以與膜上的受體結合并引發(fā)cAMP的快速產(chǎn)生。之后，又有研究表明，定位在質(zhì)膜上的雌激素受體可以誘導膜起始的雌激素介導的信號轉(zhuǎn)導通路的發(fā)生。這一膜起始的信號轉(zhuǎn)導通路可以激活許多胞質(zhì)內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導相關蛋白的表達及膜雌激素起始的信號通路的活化，主要包括腺苷酸環(huán)化酶，G蛋白偶聯(lián)受體，促有絲分裂原活化蛋白激酶和磷脂酰3激酶等信號轉(zhuǎn)導通路。作為腫瘤抑制

5、因子，在乳腺上皮細胞中，Cav-1表達下調(diào)對乳腺癌早期轉(zhuǎn)化和ER介導的信號轉(zhuǎn)導通路的作用機制還需要進一步的深入研究。 本實驗以利用基因捕獲技術獲得的Cav-1單倍不足細胞株(MCF10A-ST1，MCF 10A-ST3)和其母細胞株MCF 10A為研究對象，應用免疫共沉淀技術檢測Cav-1與ERα之間的相互作用關系，小RNA干擾技術沉默乳腺上皮細胞Cav-1表達，利用Western Blot檢測了ERα及其介導的信號轉(zhuǎn)導通路相關

6、蛋白的表達水平，探討Cav-1的表達水平與ER介導的信號轉(zhuǎn)導通路的關系及其可能的分子機制。旨在闡明Cav-1在人正常乳腺細胞早期轉(zhuǎn)化中的部分作用機制，為進一步揭示乳腺癌發(fā)病機理提供直接的科學依據(jù)。 結果如下：(1)利用siRNA干擾技術，我們成功建立了Cav-1基因沉默細胞模型--7SD8；(2)在MCF 10A和ST3細胞中，Cav-1與ERα均具有相互作用關系，并且隨著Cav-1表達不斷下降，Cav-1與ERα之間的結合能力

7、越來越強；(3)在瞬時轉(zhuǎn)染MCF 10A細胞96小時后，Cav-1表達發(fā)生明顯降低，并且隨著Cav-1表達不斷下降，ERα-66的表達明顯升高，而ERα-36的表達卻是先下降后又重新升高；(4)在瞬時轉(zhuǎn)染ST1細胞時，隨著轉(zhuǎn)染時間的不斷增加，Cav-1蛋白的表達水平不斷下降；(5)在Cav-1進一步下降的過程中，磷酸化ERK蛋白的表達量在瞬時轉(zhuǎn)染ST1細胞48小時和72小時后發(fā)生明顯的增加，在96小時后又恢復正常，而總ERK1/2蛋白的

8、表達水平無明顯變化，并且在7SD8細胞株中我們同樣檢測到較高水平的磷酸化ERK1/2蛋白的表達：(6)磷酸化AKT蛋白的表達在轉(zhuǎn)染72小時后發(fā)生明顯上調(diào)，而總AKT蛋白的表達也在轉(zhuǎn)染48小時后發(fā)生明顯上調(diào)，同時其上游分子P13K蛋白的表達在轉(zhuǎn)染48h和72h時也發(fā)生明顯上調(diào)，其下游分子P21蛋白的表達在轉(zhuǎn)染48小時和96小時后發(fā)生明顯降低。(7)在Cav-1表達短暫下調(diào)的過程中，細胞周期蛋白Cyclin D1的表達水平并無明顯變化。