柿果ACC氧化酶基因cDNA克隆及其植物表達載體的構建.pdf

1、柿果屬于躍變型果實，采收后極易軟化，給柿果的貯藏運輸帶來不便。大量研究證實，乙烯是躍變型成熟果實的催熟激素。躍變型果實中自我催化的乙烯合成反應啟始后，合成大量乙烯。利用轉基因技術抑制或降低果實乙烯的生物合成，可以降低果實乙烯的含量。ACC合成酶和ACC氧化酶是果實乙烯生物合成的限速酶，通過轉基因的方法抑制這兩種酶的表達，可望提高躍變型果實的耐貯性能。本研究以柿果實為材料，克隆分離了富有柿ACC氧化酶基因，成功構建了該基因的反義和RNA干

2、擾表達載體，結果如下： 1．利用Rneasy Plant Mini Kit試劑盒成功提取了高質量的RNA，RNA的OD<,260>/OD<,280>比值為2.0979，為mRNA的反轉錄奠定了基礎。 2．mRNA的反轉錄采用了QIAGEN公司的反轉錄試劑盒(Omniscript<'TM>RTKit)，分離到完整性好的mRNA，為繼后的RT-PCR提供可靠保證。 3．根據(jù)已發(fā)表的平核無柿ACC氧化酶的保守氨基酸序列

3、，設計了一對特異性引物，進行RT-PCR擴增，得到一個長592bp的cDNA片段，經(jīng)序列分析證明該片段具有ACC氧化酶的保守區(qū)氨基酸序列，與GenBank中平核無柿果的DK-AC01基因核苷酸序列及所編碼的氨基酸序列同源性達98％，說明克隆到的片段是富有柿果ACC氧化酶基因片段。 4．通過分析已獲得ACC氧化酶基因片段，在內含子兩端分別設計含有EcoRV酶切位點的引物，通過酶切將兩個PCR擴增產物連接成一條基因片段，并轉化到大腸

4、桿菌DH5a中經(jīng)過鑒定及測序，證明得到了去除內含子的基因片段。 5．用限制性內切酶Xba Ⅰ和BamH Ⅰ酶切克隆到的富有柿果ACC氧化酶核苷酸序列和pBI221質粒載體，將ACC氧化酶的序列反向克隆到了pBI221質粒中，構建成中間表達載體pBI-anti-ACO。 6．用Sma Ⅰ和HindⅢ酶切構建好的中間載體pBI-anti-ACO和pSMAK311質粒，切下中間載體質粒上的CaMV 35S啟動子和ACO的反義序

5、列，將其插入到切除CaMV 35S啟動子的pSMAK311質粒中，構建成反義表達載體pSMAK-anti-ACO。 7．用BamH Ⅰ和Sma Ⅰ分別酶切反義中間表達載體質粒pBI-anti-ACO和富有柿果ACC氧化酶核苷酸序列，將ACC氧化酶的序列正向插入到中間載體pBI-anti-ACO質粒中，構建成中間表達載體pBI-ACO-RNAi。 8．用Sma Ⅰ和HindⅢ酶切構建好的中間載體pBI-ACO-RNAi和p