降鈣素基因相關(guān)肽對ALI時小鼠巨噬細胞替代激活的影響.pdf

1、巨噬細胞為免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細胞，其在機體中執(zhí)行的功能由其特定的激活方式?jīng)Q定。巨噬細胞的激活大致分為兩種:經(jīng)典激活和替代激活。其中替代激活在炎癥反應(yīng)后期較為常見，發(fā)生替代激活的巨噬細胞通過分泌多種抗炎和促修復(fù)介質(zhì)參與炎癥消退與組織修復(fù)。體外IL-4可誘導(dǎo)巨噬細胞替代激活，精氨酸酶-1（Arg-1）和IL-10是巨噬細胞替代激活的標志性蛋白。在多種肺部疾病的發(fā)生、發(fā)展中均存在不同表型巨噬細胞激活的失衡。急性肺損傷(ALI)時，巨噬細胞替代

2、激活可有效調(diào)控炎癥反應(yīng)，加速ALI的損傷修復(fù)。因此，尋找促進巨噬細胞替代激活的內(nèi)外源性物質(zhì)，對ALI時的瀑布式炎癥反應(yīng)進行及時、有效的干預(yù)，對防治ALI的炎癥遷延、促進損傷修復(fù)意義重要。
　　降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）是肺內(nèi)含量最為豐富的神經(jīng)肽。研究表明CGRP主要通過調(diào)控炎癥介導(dǎo)的巨噬細胞趨化因子和細胞因子的產(chǎn)生，進而發(fā)揮對巨噬細胞的免疫功能的調(diào)節(jié)作用，但其對巨噬細胞替代激活的影響尚未見相關(guān)報道。本課題將從整體和細胞水平分別觀

3、察小鼠ALI動物模型和LPS應(yīng)激的小鼠巨噬細胞CGRP的表達變化，并研究CGRP對IL-4誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞替代激活的影響及其可能機制。
　　目的:觀察ALI時小鼠肺組織內(nèi)CGRP mRNA表達的變化，探討CGRP對IL-4誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞替代激活的影響及其可能機制。
　　方法:
　　1.動物模型復(fù)制:腹腔注射LPS復(fù)制小鼠ALI動物模型，采用RT-PCR法分別檢測不同時間點小鼠肺內(nèi)CGRP mRNA的相對表達量。<

4、br>　　2.細胞模型復(fù)制和時效量效檢測:IL-4處理小鼠巨噬細胞(RAW264.7，ATCC: TIB-7TM)復(fù)制小鼠巨噬細胞替代激活模型，觀察CGRP對小鼠巨噬細胞替代激活的影響。采用RT-PCR法檢測各組Arg-1及IL-10 mRNA的相對表達。Arg-1相對表達的時效檢測:時間點選取IL-4處理后的0h、8h、16h和24 h，CGRP濃度為10-7M，預(yù)處理時間為1 h;Arg-1相對表達的量效檢測:IL-4處理時間為24

5、 h，CGRP濃度為10-8、5×10-8、10-7和5×10-7 M，預(yù)處理時間為1h。
　　3.信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制:采用鈣調(diào)蛋白信號通路阻斷劑(W7)、PKC信號通路阻斷劑(H7)、和PKA信號通路阻斷劑(H89)預(yù)處理，觀察CGRP促進IL-4誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞Arg-1 mRNA表達的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。
　　結(jié)果:
　　1.ALI小鼠肺內(nèi)CGRP mRNA的表達RT-PCR檢測ALI小鼠0h、8h、16h、24 h肺內(nèi)

6、CGRP mRNA水平的相對表達。結(jié)果顯示:與對照組相比，ALI小鼠肺內(nèi)CGRP的表達明顯增高;8h即達峰值，16h和24 h較8h時表達略微降低。
　　2.LPS應(yīng)激下小鼠巨噬細胞內(nèi)CGRP mRNA的表達LPS處理小鼠巨噬細胞，8h后RT-PCR檢測其CGRP mRNA的表達，與對照組相比，LPS處理明顯增加CGRP mRNA的表達量。
　　3.CGRP對IL-4誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞替代激活標志分子Arg-1和IL-10mR

7、NA表達的影響
　　(1) Arg-1: RT-PCR結(jié)果顯示，CGRP預(yù)處理對靜息狀態(tài)小鼠巨噬細胞Arg-1 mRNA的表達無影響，但可呈時間依賴性(0、8、16、24h)和濃度依賴性(10-8、5×10-8、10-7、5×10-7 M)促進IL-4誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞替代激活時Arg-1 mRNA的表達。
　　(2) IL-10: RT-PCR結(jié)果顯示，靜息狀態(tài)小鼠巨噬細胞IL-10mRNA表達水平較低，CGRP預(yù)處理可促

8、進IL-4誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞IL-10 mRNA的表達。
　　4.CGRP促進IL-4誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞Arg-1 mRNA表達的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制RT-PCR檢測結(jié)果顯示:與對照組相比，IL-4可促進小鼠巨噬細胞Arg-1 mRNA的表達，CGRP可進一步增加其表達;而鈣調(diào)蛋白信號通路阻斷劑(W7)、PKC信號通路阻斷劑(H7)和PKA信號通路阻斷劑(H89)預(yù)處理均可抑制CGRP對IL-4的促進效應(yīng)。
　　結(jié)論: