湖羊BMP7啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究.pdf

1、前期在湖羊羔皮毛囊中利用基因芯片技術(shù)篩選出不同花紋間差異表達基因BMP7，結(jié)合湖羊羔皮毛囊組織學(xué)特性關(guān)聯(lián)分析，確定BMP7作為候選基因，BMP7蛋白是TGF-β超家族中最大的分泌型信號傳導(dǎo)分子之一，BMP7除了與骨形成發(fā)生有關(guān)，還被發(fā)現(xiàn)與羽毛胚芽的大小和空間分布有關(guān)，在毛囊的發(fā)育與毛發(fā)生的生長中起著重要作用，但本身的調(diào)控機制并不清楚。為此，本研究對BMP7的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制進行初步研究，首先對湖羊不同組織進行BMP7表達水平分析，其次克隆B

2、MP7近端啟動子進行生物信息學(xué)分析，接著根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果與近端啟動子序列構(gòu)建系列缺失載體雙熒光素活性檢測，最后對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點定點突變和轉(zhuǎn)錄因子過表達驗證，從而揭開BMP7啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，為后續(xù)的研究提供依據(jù)。本研究主要通過以下幾個方面研究BMP7的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制:
　　(1)利用RT-qPCR對BMP7在湖羊的各個組織表達情況進行分析，發(fā)現(xiàn)在羔皮毛囊組織中高表達。
　　(2)通過NCBI數(shù)據(jù)庫得到BMP7轉(zhuǎn)錄

3、起始點上游大約2000bp下游500bp的調(diào)控序列，以2500bp的序列為基礎(chǔ)進行近端啟動子克隆，獲得了1757bp的序列。對BMP7近端啟動子上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域進行了生物信息學(xué)預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)在BMP7近端啟動子上游調(diào)控區(qū)存在-1216bp—-1166bp與-632bp—-582bp兩個轉(zhuǎn)錄起始位點;對CpG島分布情況分析，發(fā)現(xiàn)-549bp—+295bp處富含CpG島，進行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測，發(fā)現(xiàn)有SP1、EGR1、NRF1、TFAP2

4、B等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。
　　(3)根據(jù)BMP7近端啟動子序列設(shè)計啟動子系列缺失片段，將各個缺失片段構(gòu)建到雙熒光素酶報告基因載體上，轉(zhuǎn)染293T細胞進行雙熒光酶檢測不同缺失片段活性并進行顯著性比較，尋找雙熒光素酶活性最高的序列片段，發(fā)現(xiàn)核心區(qū)域-758bp—-545bp之間活性較高，對其進行生物信息學(xué)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)存在轉(zhuǎn)錄因子SP1、EGR1可能結(jié)合位點，對BMP7啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控起著一定作用。
　　(4)為了進一步鑒定BMP7近端