酸敏感離子通道在酸誘導的大鼠關節(jié)軟骨細胞凋亡中的作用及其線粒體途徑機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、背景:類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種不明病因的臨床綜合征,以慢性多關節(jié)炎癥為主要表現,由于炎癥導致關節(jié)局部組織酸化,關節(jié)腔內滑液pH顯著下降。酸敏感離子通道(Acid-sensing ion channels,ASICs)是一類配體門控性離子通道,屬上皮鈉通道(EnaC)/退化因子基因(DEG)通道家族中的一個成員,能被細胞外pH下降或H+濃度上升激活。本課題組前期研究證實在佐劑性關節(jié)炎(Adjuv

2、ant Arthritis,AA)大鼠關節(jié)軟骨細胞上有ASICs的表達,并參與病理情況下的關節(jié)軟骨代謝過程。
  目的:本研究以體外培養(yǎng)的大鼠關節(jié)軟骨細胞為實驗對象,采用不同程度的胞外酸化刺激大鼠軟骨細胞凋亡,觀察ASICs阻斷劑阿米洛利(Amiloride)對大鼠軟骨細胞凋亡的影響,以探討ASICs在大鼠軟骨細胞凋亡過程中的作用及其可能的分子機制。
  方法:
  1.采用Ⅱ型膠原酶消化法分離大鼠關節(jié)軟骨細胞,將細胞

3、分為四組分別在pH為7.4、6.5、6.0、5.5的培養(yǎng)基孵育,建立關節(jié)軟骨細胞凋亡體外模型,MTT法檢測不同程度酸化刺激對軟骨細胞生存率的影響,Hoechst染色法和Annexin V/PI雙標記法分別觀察軟骨細胞凋亡形態(tài)和凋亡率的變化。
  2.將軟骨細胞分為pH7.4環(huán)境下培養(yǎng)的正常組,pH6.0的酸化組,以及經不同濃度Amiloride(50,100,or200μM)處理的酸化組,MTT法檢測不同組別軟骨細胞的生存率變化,

4、吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)染色法和Annexin V/PI雙標記法分別觀察軟骨細胞凋亡形態(tài)和凋亡率的變化,羅丹明123(Rhodamine123,Rh123)染色在熒光顯微鏡下檢測軟骨細胞線粒體膜電位變化,RT-PCR檢測各組細胞Bcl-2家族凋亡基因mRNA的表達,比色法、免疫細胞化學檢測Caspase-3/9活性和蛋白的表達。
  結果:
  1.胞外酸化對體外培養(yǎng)的軟骨細胞增殖的抑制作用
  pH5.5和pH

5、6.0胞外酸化刺激均能明顯抑制體外培養(yǎng)的軟骨細胞增殖,結合流式細胞儀檢測的細胞凋亡率(15.94%、22.18%),酸化組細胞減少可能是由于酸中毒引起軟骨細胞凋亡造成的,且凋亡率與酸性程度相關,由此可以推測酸中毒誘導凋亡的能力與酸中毒的程度有關。
  2.酸敏感離子通道阻斷劑(Amiloride)對胞外酸化關節(jié)軟骨細胞凋亡的影響
  MTT檢測發(fā)現Amiloride各劑量組軟骨細胞生存率明顯高于酸化模型組;AO/EB染色發(fā)現

6、酸化模型組早期凋亡細胞增多,表現為細胞核被AO染色呈黃綠色熒光,晚期凋亡細胞亦增多表現為被EB染色呈桔紅色;而Amiloride處理組凋亡細胞明顯減少;Annexin-V聯合PI雙標記法行流式細胞術檢測結果顯示Amiloride各劑量組軟骨細胞凋亡率明顯低于酸化模型組;Rh123染色結果顯示Amiloride各劑量組軟骨細胞線粒體膜電位明顯高于酸化模型組。
  3.酸敏感離子通道阻斷劑 Amiloride對胞外酸化關節(jié)軟骨細胞凋亡

7、線粒體途徑有關凋亡基因和蛋白表達的影響
  RT-PCR結果顯示Amiloride各劑量組軟骨細胞Bcl-2和Bax凋亡基因表達與酸化模型組差異具有顯著性;分光光度法檢測結果顯示Amiloride組軟骨細胞Caspase-3/9活性明顯低于酸化模型組;免疫細胞化學法結果顯示Amiloride組軟骨細胞Caspase-3/9、Cytochrome C蛋白的表達與酸化模型組差異具有顯著性。
  結論:
  1.胞外酸化環(huán)境

8、下能明顯抑制體外培養(yǎng)軟骨細胞增殖、促進軟骨細胞凋亡,并隨著酸化的程度增加而加劇。
  2.酸敏感離子通道阻斷劑Amiloride對于經胞外酸化處理的體外培養(yǎng)的關節(jié)軟骨細胞的凋亡有抑制作用。
  3.利用Amiloride阻斷ASICs對酸誘導的軟骨細胞凋亡有抑制作用,其可能的機制是通過阻斷ASICs,抑制Ca2+超載,保護軟骨細胞線粒體功能,調節(jié)Bcl-2家簇凋亡基因的表達,控制Cyt-c的釋放和Caspase凋亡執(zhí)行蛋白的

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